本發明專利技術提供了一種檢測沙丁胺醇藥物的膠體金試紙卡，包括樣品吸收墊、結合物釋放墊、反應膜、吸水墊和背襯。在所述反應膜上有包被有沙丁胺醇-載體蛋白偶聯物構成的檢測線和包被有羊抗鼠抗抗體構成的質控線，結合物釋放墊包被有沙丁胺醇單克隆抗體-膠體金標記物。本發明專利技術還提供了一種應用上述沙丁胺醇膠體金試紙卡檢測沙丁胺醇藥物的方法。本發明專利技術所提供的試紙卡可用于檢測尿液、豬肉、雞肉、魚、蝦、飼料樣品中沙丁胺醇藥物殘留，具有操作簡單、靈敏度高、檢測速度快、成本低，適合大量樣本的篩查和現場監控。
【技術實現步驟摘要】
本專利技術涉及。
技術介紹
沙丁胺醇是一種強效選擇性β -受體興奮劑藥物，臨床上常用于治療支氣管哮喘、哮喘性支氣管炎和肺氣腫患者的支氣管痙攣等呼吸系統疾病。因此藥可以提高瘦肉率，減少脂肪沉積和促進動物生長，被一些畜牧養殖企業作為養殖促進劑非法使用。其殘留量可導致人體肌肉震顫、心悸、神經過敏、頭痛、目眩、惡心、嘔吐、發燒、戰栗等癥狀，對消費者的健康極有危害，我國農業部發布的《食品動物禁用的獸藥及其它化合物清單》明確規定沙丁胺醇等β -興奮劑被禁止所有用途，禁用所有食品動物。目前，對于沙丁胺醇的殘留檢測主要有高效液相色譜法、液相色譜 質譜聯用分 析法、氣相色譜法、毛細管區帶電泳法、免疫測定法等檢測方法，儀器檢測方法具有檢測精確度高的優點，但其儀器化程度高，樣品處理較復雜、檢測費用高等，不適合用作大批樣品的檢測，免疫學檢測方法操作簡單、快速、靈敏，可同時檢測多數樣品，是理想的快速篩選手段。
技術實現思路
本專利技術的目的是提供一種操作簡單、成本低的沙丁胺醇藥物殘留檢測膠體金試紙卡及其檢測方法。本專利技術所提供的檢測沙丁胺醇藥物殘留的膠體金試紙卡，包括樣品吸收墊、結合物釋放墊、反應膜、吸水墊和PVC底板，所述反應膜上有包被有沙丁胺醇-載體蛋白偶聯物構成的檢測線和包被有羊抗鼠抗抗體構成的質控線，所述結合物釋放墊包被有沙丁胺醇單克隆抗體-膠體金標記物。上述反應膜上檢測線處包被的沙丁胺醇-載體蛋白偶聯物由沙丁胺醇半抗原與載體蛋白偶聯得到；所述的沙丁胺醇單克隆抗體-膠體金標記物中的沙丁胺醇單克隆抗體由沙丁胺醇-載體蛋白偶聯物作為免疫原免疫動物獲得；所述的載體蛋白為牛血清白蛋白、鼠血清蛋白、兔血清蛋白、甲狀腺蛋白、卵清蛋白、血藍蛋白或人血清白蛋白；所述羊抗鼠抗抗體是將鼠源抗體免疫羊得到的。本專利技術中包被原、免疫原、單克隆抗體的合成過程為1.半抗原合成(I)取l-3g沙丁胺醇，溶入20-50ml DMF中，然后加入10%摩爾當量的TEMPO和10%摩爾當量的四丁基氯化銨，20-50ml O. 5M的NaHCO3水溶液，室溫下攪拌30分鐘后，力口Al. 1-1. 5摩爾當量的NCS，室溫反應2-5小時后，除去大部分溶劑，乙酸乙酯萃取，洗滌，干燥，除去溶劑后柱層析純化，得到白色固體，為沙丁胺醇單氧化物。(2) l-2g步驟(I)所得沙丁胺醇氧化物，溶入20-30ml DMF中，加入2-5摩爾當量的乙二胺，室溫至100°C反應5-20小時，除去溶劑，乙醇-水中重結晶，得到白色固體，為沙丁胺醇單氧化物的乙二胺縮合產物，即為沙丁胺醇半抗原。2.免疫原的合成(I)取沙丁胺醇半抗原18mg用1. 5ml水溶解。(2)取50%的GA8yl加入(I)中，室溫下攪拌反應18h。(3)取BSAlOOmg用5. 5ml水稀釋后加入上述溶液中。(4)反應 24h 后加入 24mgNaBH4 反應 2h。(5)用三蒸水透析48小時，即得免疫原。3.包被原的合成(I)取沙丁胺醇半抗原15mg用1. 5ml水溶解。(2)取50%的GA8yl加入(I)中，室溫下攪拌反應18h。(3)取0VA30mg用4. 5ml水稀釋后加入上述溶液中。(4)反應 24h 后加入 24mgNaBH4 反應 2h。(5)用三蒸水透析48小時，即得包被原。4.單克隆抗體的制備動物免疫沙丁胺醇半抗原與載體蛋白偶聯物免疫8-10周齡Bal b/c小鼠。細胞融合與克隆化取免疫后的鼠脾細胞，與SP2/0骨髓瘤細胞在融合劑聚乙二醇(PEG)4000的作用下融合，篩選獲得能穩定分泌單克隆抗體的雜交瘤細胞株。本專利技術提供了一種制備上述膠體金試紙卡的方法，主要包括如下步驟(I)制備包被有沙丁胺醇單克隆抗體-膠體金標記物的結合物釋放墊；(2)制備具有包被有沙丁胺醇-載體蛋白偶聯物構成的檢測線和包被有羊抗鼠IgG構成的質控線的反應膜；(3)將(I)和(2)制備好的結合物釋放墊、反應膜與樣本吸收墊、吸水墊和背襯組裝成試紙卡。具體的說，步驟包括I)制備獲得沙丁胺醇半抗原；2)將沙丁胺醇半抗原與載體蛋白偶聯，制備沙丁胺醇包被原和免疫原；3)用沙丁胺醇免疫原免疫小鼠,將小鼠脾細胞和小鼠骨髓瘤細胞通過融合、篩選，得到分泌沙丁胺醇單克隆抗體的雜交瘤細胞株；4)提取小鼠IgG免疫健康山羊，得到羊抗鼠IgG抗體；5)用檸檬酸三鈉與氯金酸反應制備膠體金；6)將制備的沙丁胺醇單克隆抗體加入到制備的膠體金中，得到沙丁胺醇單克隆抗體-膠體金標記物；7)將結合物釋放墊浸泡于含有牛血清白蛋白(牛血清白蛋白在緩沖液中的濃度為O. 5% )和pH7. 2,0. 5mol/L磷酸鹽緩沖液中浸濕lh，37°C烘3h備用，然后將沙丁胺醇單克隆抗體-膠體金標記物包被到結合物釋放墊上；8)將沙丁胺醇-卵清蛋白偶聯物包被到反應膜上構成檢測線，將羊抗鼠抗抗體包被在反應膜上構成質控線；9)將樣品吸收墊置于pH為7. 2，含小牛血清2%，I %活性劑，O. 02mol/L磷酸鹽緩沖液浸泡2h，37°C下烘干2h后備用；10)將上述樣品吸收墊、結合物釋放墊、反應膜、吸水墊依次按順序黏貼在PVC底板上；結合物釋放墊從起始端有1/3區域被樣品吸收墊覆蓋，結合物釋放墊的末端與反應膜的始端連接，反應膜的末端與吸水墊的始端相連，樣品吸收墊的始端與PVC底板的始端對齊，吸水墊的末端與PVC底板的末端對齊；所述反應膜上有檢測區和質控區，檢測區(T)線和質控區(C)線均為與所述試紙的長相垂直的條狀帶；檢測區位于靠近結合物釋放墊的末端的一側；質控區位于遠離結合物釋放墊的末端的一側；將試紙用機器切成3_寬的小條，裝在特制的塑料制卡中，形成試紙卡，2 8°C條件下保存12個月。本專利技術還提供了一種應用上述膠體金試紙卡檢測沙丁胺醇的方法，包括的步驟有(I)樣品的前處理尿液樣品尿液樣品必須收集在潔凈干燥，不含任何防腐劑的塑料尿杯或玻璃容器中。若不能及時送檢，尿樣在2-8°C冷藏可保存4小時，長期保存需冷凍-20°C，嚴禁反復凍融。檢測前尿樣需回溫到室溫，如尿樣渾濁，需3000rpm以上離心5min后檢測。豬肉、雞肉、魚肉、蝦等組織取去脂肪組織樣品于均質器中均質lmin (lOOOOrpm)，稱取一定量(1. Og)均質的組織樣品到4ml離心管中，加入樣品提取液(含O. 8%的氯化鈉的pH7. 2的O. 02mol/L的磷酸鹽緩沖液)200 μ 1，渦動Imin ;放入80_100°C水中水浴15min，取出冷卻至室溫，待檢。飼料研碎飼料樣品，稱取1. Og飼料樣品到4ml離心管中，加入Iml乙腈，渦動lmin，靜置5min ;移取50 μ I上清液至150 μ I樣本稀釋液(pH7. 2,0. 02mol/L的磷酸鹽緩沖液)中混勾待檢。(2)用膠體金試紙卡檢測用吸管吸取待檢樣品溶液垂直滴加3 4滴(約80 μ I)于加樣孔，反應lOmin，根據示意圖判定結果。(3)分析檢測結果本專利技術將沙丁胺醇-載體蛋白偶聯抗原固化于反應膜上檢測線處，結合物釋放墊上含有沙丁胺醇單克隆抗體-膠體金標記物，在層析過程中樣品中殘留的沙丁胺醇藥物和反應膜上預包被的偶聯抗原競爭膠體金標記的沙丁胺醇單克隆抗體，通過檢測線是否顯色判斷樣品中是否有沙丁胺醇藥物的殘留，當檢測線(T線)和質控線(C線)都顯色時為陰本文檔來自技高網...
【技術保護點】
一種檢測沙丁胺醇藥物的膠體金試紙卡，包括樣品吸收墊、結合物釋放墊、反應膜、吸水墊和PVC底板，其特征在于所述反應膜上有包被有沙丁胺醇?載體蛋白偶聯物構成的檢測線和包被有羊抗鼠抗抗體構成的質控線，所述結合物釋放墊包被有沙丁胺醇單克隆抗體?膠體金標記物。
【技術特征摘要】
1.一種檢測沙丁胺醇藥物的膠體金試紙卡，包括樣品吸收墊、結合物釋放墊、反應膜、吸水墊和PVC底板，其特征在于所述反應膜上有包被有沙丁胺醇-載體蛋白偶聯物構成的檢測線和包被有羊抗鼠抗抗體構成的質控線，所述結合物釋放墊包被有沙丁胺醇單克隆抗體-膠體金標記物。2.如權利要求1所述的膠體金試紙卡，其特征在于所述的沙丁胺醇-載體蛋白偶聯物由沙丁胺醇半抗原與載體蛋白偶聯得到；所述的沙丁胺醇單克隆抗體-膠體金標記物中的沙丁胺醇單克隆抗體由沙丁胺醇-載體蛋白偶聯物作為免疫原免疫動物獲得；所述的載體蛋白為牛血清白蛋白、鼠血清蛋白、兔血清蛋白、甲狀腺蛋白、卵清蛋白、血藍蛋白或人血清白蛋白；所述羊抗鼠抗抗體是將鼠源抗體免疫羊得到的。3.如權利要求1或2所述的膠體金試紙卡，其特征在于所述的沙丁胺醇半抗原的制備方法主要包括如下步驟(1)取l_3g沙丁胺醇，溶入20-50mlDMF中，然后加入10%摩爾當量的TEMPO和10%摩爾當量的四丁基氯化銨，20-50ml O. 5M的NaHCO3水溶液，室溫下攪拌30分鐘后，加入1.1-1. 5摩爾當量的NCS，室溫反應2-5小時后，出去大部分溶劑，乙酸乙酯萃取，洗滌，...
【專利技術屬性】
技術研發人員：馮才偉，羅曉琴，朱亮亮，崔海峰，湯慶彩，崔彥虎，張荃，其他發明人請求不公開姓名，
申請(專利權)人：北京勤邦生物技術有限公司，
類型：發明
國別省市：
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