本發(fā)明專利技術提供了一種檢測生物體內組織鄰苯二甲酸二丁酯（DBP）相對含量的方法。利用DBP人工抗原免疫小鼠而制得DBP單克隆抗體，用DBP單克隆抗體與生物組織樣品中的DBP結合，再通過熒光二抗標示DBP的分布。本發(fā)明專利技術還可以通過圖像分析軟件分析熒光強度，從而計算DBP的含量。本發(fā)明專利技術對DBP的含量和分布可以進行可視化分析，靈敏度高，方便快捷，穩(wěn)定性好，成本低廉。
【技術實現步驟摘要】
本專利技術涉及，屬于生物技術 領域。
技術介紹
近年來在許多國家和地區(qū)，塑化劑對食品、環(huán)境的污染引起了人們強烈的擔憂。鄰 苯二甲酸二丁酯(DBP)屬于苯二甲酸酯類化合物，被普遍應用于塑料制品、膠水、油漆、指 甲油、洗發(fā)水和沐浴液等數百種產品中。鄰苯二甲酸二丁酯是半揮發(fā)性化合物，不與終產品 共價結合，在生產和生活中，被不斷地釋放到大氣、土壤和水環(huán)境中。環(huán)境中的鄰苯二甲酸 二丁酯又通過呼吸、飲食、皮膚接觸等三種途徑進入人體。因此，人類正面臨著越來越高的 鄰苯鄰苯二甲酸二丁酯暴露風險。有研究報告指出我國普通人群DBP日攝入量為12. 2ug/ kg bw,高于世界平均水平。動物模型研究和流行病學調查發(fā)現鄰苯二甲酸二丁酯可以引起雄性生殖發(fā)育的 障礙。鄰苯二甲酸酯還具有免疫毒性，能導致兒童產生哮喘、濕疹、鼻炎等持久性過敏癥。此 外，鄰苯二甲酸二丁酯還能能導致糖尿病、肥胖癥等。因此，鄰苯二甲酸二丁酯檢測已成為食品安全、環(huán)境監(jiān)測、毒理學研究等領域的重 要工作。由于鄰苯二甲酸二丁酯在水環(huán)境、生物體內的含量較低，常常在檢測域以下，因此 鄰苯二甲酸二丁酯的含量分析是一件非常困難的工作。早期用含同位素14C的DBP飼喂實驗動物，然后檢測體內組織中的放射性水平來評 價DBP的水平。但是由于DBP在生物體內降解快，所檢測到的放射量只是DBP和降解代謝 物的總體水平，并不能代表DBP在生物組織內的真正含量。現在DBP的分析多采用氣相色譜(GC)、HLPC、GC-質譜聯用法等色譜分析技術， 但這些技術需要進行樣品前處理等，耗時多，并且有較高的儀器要求，色譜柱等耗材價格昂 貴，此外，還需要操作人員有豐富的經驗。免疫分析由于選擇性強、靈敏度高，一次可檢測多種樣品，因此把免疫分析技術應 用于DBP檢測具有簡便、快速、成本低的優(yōu)點。張明翠等用一種DBP的多克隆抗體，通過免疫 組化法分析了水和包裝的食品中DBP的含量。Yanaihara等運用酶聯免疫分析法(ELISA) 分析了鄰苯二甲酸酯類物質的含量。但是，這兩個研究都是基于多克隆抗體的免疫分析。多 克隆抗體對抗原的專一選擇性、靈敏度上都不及單克隆抗體。多克隆抗體受限于實驗動物， 不能無限制的獲取。此外，由于從不同動物個體中獲取的多克隆抗體的選擇性、靈敏度、效 價等都不同，因此用多克隆抗體建立同一標準的免疫分析方法就很困難。
技術實現思路
針對現有技術的不足，本專利技術所要解決的技術問題是提供操作簡便、靈敏度高的檢測生物體內鄰苯二甲酸二丁酯相對含量的方法。本專利技術利用DBP結構類似物作為半抗原連接載體蛋白OVA而制得人工抗原，該人工抗原免疫小鼠所得脾細胞和瘤細胞雜交融合而篩選得到能穩(wěn)定分泌DBP單克隆抗體的細胞株，小鼠腹水法大量制備DBP單克隆抗體。取待測生物組織樣品制成冰凍切片，用該 DBP單克隆抗體與生物組織樣品中的DBP結合，再通過熒光二抗標示DBP的分布。通過圖像分析軟件IPP分析熒光強度，從單位面積熒光值計算DBP的相對含量。本專利技術所采用的技術方案是(O利用DBP結構類似物4-氨基鄰苯二甲酸二丁酯(DBAP)作為半抗原連接載體蛋白 OVA而制得人工抗原，用該人工抗原免疫小鼠所得脾細胞和瘤細胞雜交融合，而篩選得到能穩(wěn)定分泌DBP單克隆抗體的細胞株，通過小鼠腹水法大量制備DBP單克隆抗體；(2)取待測生物組織樣品制成冰凍切片，用(I)所得DBP單克隆抗體與生物組織樣品中的DBP結合，再通過熒光二抗標示DBP的分布；(3)通過圖像分析軟件分析熒光強度，從單位面積熒光值計算DBP的相對含量。本專利技術將單克隆抗體技術、免疫熒光技術和圖像分析軟件技術相結合。更具體地， 可采用如下步驟O用人工抗原DBAP-OVA免疫小鼠，取免疫小鼠脾細胞與瘤細胞融合，篩選出陽性雜交瘤細胞并克隆化，通過小鼠腹水法大量制備單克隆抗體，再通過硫酸銨沉淀法純化DBP 單克隆抗體；2)抗體效價檢測；3)載玻片預處理將載玻片用王水浸泡過夜，大量流水沖洗干凈并晾干，再在DEPC水配制的多聚賴氨酸溶液中浸泡30min，室溫晾干備用；4)生物組織材料切片和封閉取待測生物組織樣品用4%PFA固定I小時，再用液氮冰凍并用OCT包埋樣品，用冰凍切片機 在_20°C下將包埋樣品切成5-10 μ L薄片，將冰凍切片貼于載玻片上在37°C烘干lh，冷卻至室溫，在臥式染缸中用PBS將載玻片洗3次，每次 IOmin ;用5%的溶于PBS的奶粉在室溫下封閉Ih ；5)DBP單克隆抗體結合DBP :用PBS沖洗載玻片洗去牛奶，加入DBP單克隆抗體孵育， 每片加200yL 1%溶于PBS的奶粉，按1:100比例稀釋DBP單克隆抗體，4°C孵育過夜；取出玻片，放入臥式染缸用PBST (PBS+0. l%Tween-20)在搖床上洗5次，每次IOmin;再用PBS 在搖床上洗3次,每次IOmin;6)二抗標記DBP單克隆抗體加入二抗和PI孵育液(1:100稀釋FITC-標記羊抗鼠血清，lOyg/ml PI，2%正常羊血清，溶于PBS)黑暗中室溫孵育lh;取出玻片，放入臥式染缸用 PBS在搖床上洗6次，每次IOmin;7)用抗淬滅劑封片，用激光共聚焦顯微鏡觀察并拍照，使用圖像軟件分析熒光強度， 從單位面積熒光值計算DBP的相對含量。比較分析各樣品DBP含量時，顯微鏡的波長等參數應一致。本專利技術對DBP含量和分布可以進行可視化分析，靈敏度高，方便快捷，穩(wěn)定性好， 成本低廉，且由于本專利技術的單克隆抗體對DBP特異性強，因此檢測結果不受其它酞酸酯的影響。本專利技術可以廣泛適用于檢測生物體內鄰苯二甲酸二丁酯的含量，評價環(huán)境中鄰苯二甲酸二丁酯的污染水平。附圖說明圖1顯示的是將大鼠通過皮膚涂抹400mg/kg/d DBP染毒五天后，取皮膚組織制成 冰凍切片，通過基于DBP單克隆抗體的免疫熒光技術分析DBP在皮膚組織內的分布。上排為DBP染毒組左為FITC綠色突光顯示DBP的分布；中為PI染色顯示細胞 核；右為前兩者的融合照片。下排為未染毒對照組左為FITC綠色熒光顯示DBP;中為PI染色顯示細胞核；右 為前兩者的融合照片。圖2顯示的是通過灌胃法將大鼠暴露于400mg/kg/d的DBP，染毒五天后，24小時 內取腎組織制成冰凍切片，通過基于DBP單克隆抗體的免疫熒光技術分析DBP在腎組織內 的分布。上排為DBP染毒組左為FITC綠色突光顯示DBP的分布；中為PI染色顯示細胞 核；右為前兩者的融合照片。下排為未染毒對照組左為FITC綠色熒光顯示DBP;中為PI染色顯示細胞核；右 為前兩者的融合照片。圖3顯示的是通過灌胃法將大鼠暴露于400mg/kg/d的DBP，染毒五天后，24小時 內取腎、肝、胃、睪丸組織制成冰凍切片，通過基于DBP單克隆抗體的免疫熒光技術分析DBP 在各組織內的分布，再通過IPP軟件分析激光共聚焦照片的熒光強度而計算DBP的相對含量。圖4顯示的是通過灌胃法將大鼠暴露于400mg/kg/d的DBP，染毒五天，分別在染毒 結束后的24小時、48小時、72小時采集腎組織樣品制成冰凍切片，通過基于DBP單克隆抗 體的免疫熒光技術分析DBP在腎組織內的分布，再通過IPP軟件分析激光共聚焦照片的熒 光強度而計算DBP的相對含量。圖5顯示的是通過灌胃法將大鼠暴露于400m本文檔來自技高網...
【技術保護點】
一種檢測生物體內鄰苯二甲酸二丁酯相對含量的方法，其特征在于：（1）利用DBP結構類似物4?氨基鄰苯二甲酸二丁酯作為半抗原連接載體蛋白OVA而制得人工抗原，用該人工抗原免疫小鼠所得脾細胞和瘤細胞雜交融合，而篩選得到能穩(wěn)定分泌DBP單克隆抗體的細胞株，通過小鼠腹水法大量制備DBP單克隆抗體；（2）取待測生物組織樣品制成冰凍切片，用（1）所得DBP單克隆抗體與生物組織樣品中的DBP結合，再通過熒光二抗標示DBP的分布；（3）通過圖像分析軟件分析熒光強度，從單位面積熒光值計算DBP的相對含量。
【技術特征摘要】
【專利技術屬性】
技術研發(fā)人員：陳明清，楊旭，曾強，魏晨曦，袁均林，丁書茂，
申請(專利權)人：華中師范大學，
類型：發(fā)明
國別省市：
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