本發明專利技術公開了一種耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（MRSA）疫苗重組蛋白抗原HI2的純化方法。HI2蛋白為耐甲氧西林金黃色葡萄球菌Hla和IsdB兩個抗原分子的活性功能片段重組融合、大腸桿菌基因工程菌表達獲得。采用對基因工程菌進行高壓破菌、鹽析、GST親和層析、PP酶切、MMC層析、凝膠過濾層析等技術，獲得高純度的耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（MRSA）重組雙亞單位基因工程蛋白HI2。該發明專利技術純化工藝簡捷、容易放大、重復性好，所獲目標蛋白純度高，動物試驗證明可有效刺激機體產生較高的體液免疫應答和良好的免疫保護作用。
【技術實現步驟摘要】
本專利技術屬于生物制藥領域，特別涉及一種耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA)疫苗重組蛋白抗原HI2的純化方法。
技術介紹
耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(methicillin-resistantStaphylococcus aureus,MRSA)是能夠感染人體任何一個部位的革蘭陽性球菌，局部感染經久不愈，全身感染死亡率高達20%，已成為全球ICU病房、燒傷、戰創傷等感染率最高的病原菌之一。萬古霉素是治療MRSA的最后一道防線，但1997以來年耐萬古霉素的MRSA相繼被分離出來，使MRSA即將面臨無抗生素可治的嚴峻挑戰。因此，加強對MRSA感染的防治研究，已迫在眉睫。因此，研發一種有效的疫苗可能是預防和控制MRSA感染及其耐藥性發展有效途徑。細菌外膜蛋白具有良好的抗原活性，這些外膜蛋白作為抗體和免疫細胞攻擊的主要靶標，可以介導對細菌最直接·有效的殺滅作用，是決定免疫反應是否對人體具有保護性的關鍵因素。IsdB不僅是MRSA —個重要外膜鉚釘蛋白，在MRSA定植粘附中期重要作用，同時它也是MRSA從宿主獲得鐵的一個主要工具。以IsdB為組分的基因工程疫苗正在進行II期臨床試驗。此外，金黃色葡萄球菌可通過產生溶血素、凝固酶、殺白細胞素等多種致病因子引起人和動物的多種疾病一溶血素(Hla)便是其中的一種重要的致病因子。Hla是一個在大多數臨床分離株上都表達的穿孔形成毒素。它與多種疾病有關如肺炎，敗血癥關節炎及腦膿瘡等。Hla單體約33kDa，以七聚體形式發揮功能，每個單體的110-150氨基酸互相靠攏在磷脂雙分子層上形成孔。隨后導致細胞膜破壞，胞內離子滲出等。其毒性很強，在很低濃度情況下即可致病。Hla抗血清能夠抑制金黃色葡萄球菌的細胞毒性作用，也能降低金黃色葡萄球菌黏附到宿主細胞上的機率。Hla免疫接種后使機體獲得抗金黃色葡萄球菌感染的保護作用。Hla和IsdB都是MRSA的固有蛋白成分，其編碼基因具有高度保守性，是MRSA疫苗重要的候選抗原。我們已經構建了既能很好去除MRSA這些蛋白對細胞的毒性，又能保持這些蛋白抗原性的重組雙亞單位基因工程蛋白HI2。目前尚未見針對(MRSA)重組雙亞單位基因工程蛋白HI2疫苗制備中的純化方法的報道。
技術實現思路
本專利技術的目的，是提供一種耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA)重組雙亞單位基因工程疫苗候選抗原HI2制備中的純化方法。該方法工藝簡單，所獲得目標蛋白純度高，回收率較好。本專利技術采用了以下步驟耐甲氧西林金黃色葡萄球菌重組雙亞單位基因工程疫苗候選抗原HI2制備中的純化方法，該抗原HI2的核苷酸序列如SEQ ID NO :1所示,氨基酸序列如SEQ ID NO :2所示，其純化方法包括以下步驟A)收集自構建表達抗原HI2的大腸桿菌工程菌高密度發酵的菌體；B)采用高壓破菌、離心，硫酸銨分步沉淀，GST親和層析、PP酶切，MMC層析、凝膠過濾層析技術的順序組合對制備的HI2進行純化，獲得了高純度的rHI2。所述步驟B具體如下I)高壓破菌將收集的耐甲氧西林金黃色葡萄球菌重組雙亞單位基因工程蛋白HI2的大腸桿菌菌體以pH7. 0-7. 5的10-20mM PBS緩沖液混勻懸浮，預冷后采用高壓勻漿破菌，高速離心，收集上清；2)硫酸銨分步沉淀4°C攪拌條件下，上清中緩慢加入終濃度為30%的硫酸銨，攪拌半小時，10000-15000g高速離心20分鐘，收集上清；上清中繼續緩慢加入終濃度為40%的硫酸銨，攪拌半小時，10000-15000g高速離心20分鐘，收集沉淀；3)沉淀復溶稱量沉淀濕重，按重量體積比1:10比例加入pH7. 0-7. 5的10_20mMPBS緩沖液，攪拌混勻10-15分鐘，10000-15000g高速離心20分鐘，收集上清；4) GST親和純化選擇GST親和層析填料進行初步純化，使用PBS-Tween80pH7. 0-7. 5條件下對目標蛋白進行純化,Prescission Protease酶(PP酶)進行酶切洗脫5) MMC層析純化步驟4)收 集的樣品，pH調至3-5，使用pH3_5的NaAC緩沖液平衡層析系統及MMC層析柱，采用ρΗΙΟ. 5-11為Na2CO3緩沖液梯度洗脫；6)凝膠過濾層析純化將步驟5)純化獲得的樣品，使用凝膠過濾Superdex層析柱純化，采用PH7. 0-7. 5的10-20mM PBS平衡層析系統及層析柱，去除痕量非目標蛋白等雜質，分離純化目標蛋白，置換緩沖液。步驟I)所采用生產或中試純化中的60_80MPa高壓勻漿破菌技術，破菌率大于96%，離心獲取破菌上清。步驟2)酸銨硫分步沉淀和步驟3)再復溶。步驟4)所述的GST親和純化，所使用的填料為GST-S印harose4B或GST_Sepharose6B 或 GST-Sepharose FastFlow 或 GST-Sepharose HP。步驟4)所使用的Prescission Protease酶帶有GST標簽，以利于去除PP酶。步驟5)所述的純化方法，MMC層析的填料為Capto MMC ；步驟6)所述的凝膠層析柱為 Superdex75 或 Superdex200 或 Superdex HR10/30。所述抗原通過以下步驟制備的I)設計正向引物和反向引物通過PCR擴增或全基因合成以獲得編碼HI2蛋白活性片段的核酸序列；2)將步驟I)所獲得的核酸序列克隆至表達載體構建重組載體，然后將該重組載體轉化至宿主菌；3)誘導轉化后的宿主菌表達重組蛋白。專利技術效果采用的本專利技術所述純化方法，從表達耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA)重組雙亞單位基因工程候選抗原(本申請明明為HI2)的大腸桿菌工程菌中可以獲得大于98%的HI2,得率60%以上，整個純化過程無需額外再置換緩沖液。經鑒定本專利技術人構建獲得的HI2分子量約為46kD。本專利技術所述的純化方法主要有硫酸銨分步沉淀、GST純化、MMC層析、分子篩各步SDS-PAGE。通過上述工藝處理不同批次的HI2作12%SDS_PAGE，呈現出單一目標蛋白條帶，分子量約為46kD。HPLC C3柱分析呈現單一的峰，純度在99%以上。等電點在pH7.1左右。不同HI2肽指紋圖譜各峰峰數均保持一致，各峰的保留時間均在±10Sec內波動，說明肽圖譜重現性好。純化后的HI2與氫氧化鋁佐劑或磷酸鋁佐劑共同注射免疫BalB/C小鼠，發現HI2加免疫佐劑組血清中的I gG水平顯著高于陰性對照組(PBS組)(P〈0. OI)，證明使用本專利技術人純化方法獲得的HI2可有效刺激機體產生較高的免疫應答。使用MRSA國際標準株252 (購自ATCC)感染，發現HI2W免疫佐劑組感染率為15%，陰性對照組(PBS組)感染率為90%，計算得出HI2抗MRSA感染的保護率為83. 3%，表明該蛋白片段具有良好的免疫原性和免疫保護性，可用作耐甲氧西林葡萄球菌重組基因工程疫苗的候選抗原。附圖說明圖1為硫酸銨沉淀SDS-PAGE結果圖，圖中，泳道1:標準蛋白；泳道2 30%硫酸銨上清；泳道3 :30%硫酸銨沉淀；泳道4 :40%硫酸銨沉淀上清；泳道5 :40%硫酸銨沉淀；圖2為HI2蛋白GST親和層析及PP酶切SDS-PAGE結果圖，圖中，泳道1:標準蛋白；泳道2 =GST結合PP酶切樣品；本文檔來自技高網...
【技術保護點】
一種耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（MRSA）疫苗重組蛋白抗原HI2的純化方法，其特征在于，包括以下步驟：A）收集自構建表達抗原HI2的大腸桿菌工程菌高密度發酵的菌體；B）采用高壓破菌、離心，硫酸銨分步沉淀，GST親和層析、PP酶切，MMC層析、凝膠過濾層析技術的順序組合對制備的HI2進行純化。
【技術特征摘要】
1.一種耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA)疫苗重組蛋白抗原HI2的純化方法，其特征在于，包括以下步驟A)收集自構建表達抗原HI2的大腸桿菌工程菌高密度發酵的菌體；B)采用高壓破菌、離心，硫酸銨分步沉淀，GST親和層析、PP酶切，MMC層析、凝膠過濾層析技術的順序組合對制備的HI2進行純化。2.根據權利要求1所述的純化方法，其特征在于，步驟B如下1)高壓破菌將收集的耐甲氧西林金黃色葡萄球菌重組雙亞單位基因工程蛋白HI2的大腸桿菌菌體以PH7. 0-7. 5的10-20mM PBS緩沖液混勻懸浮，預冷后采用高壓勻漿破菌，高速離心，收集上清；2)硫酸銨分步沉淀4°C攪拌條件下，上清中緩慢加入終濃度為30%的硫酸銨，攪拌半小時，10000-15000g高速離心20分鐘，收集上清；上清中繼續緩慢加入終濃度為40%的硫酸銨，攪拌半小時，10000-15000g高速離心20分鐘，收集沉淀；3)沉淀復溶稱量沉淀濕重，按重量體積比1:10比例加入pH7. 0-7. 5的10_20mM PBS 緩沖液，攪拌混勻10-15分鐘，10000-15000g高速離心20分鐘，收集上清；4)GST親和純化選擇GST親和層析填料進行初步純化，使用PBS-Tween80pH7. 0-7. 5 條件下對目標蛋白進行純化，Prescission Protease酶進行酶切洗脫5)MMC層析純化步驟4)收集的樣品，pH調至3-5，使用pH3_5的NaAC緩沖液平衡層析系統及MMC層析柱，采用ρΗΙΟ. 5-11為Na2CO3緩沖液梯度洗脫...
【專利技術屬性】
技術研發人員：郭鷹，鄒全明，曾浩，董衍東，樊紹文，盧陸，魯東水，章金勇，敬海明，
申請(專利權)人：重慶原倫生物科技有限公司，中國人民解放軍第三軍醫大學，
類型：發明
國別省市：
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