本發(fā)明專利技術(shù)公開了耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（MRSA）疫苗重組蛋白抗原HI2及制備方法和應用，該重組融合蛋白由金黃色葡萄球菌alpha溶血素（Hla）與鐵表面決定蛋白(IsdB)片段組成，其中，Hla與IsdB片段通過連接肽融合。該蛋白可應用于制備抗耐甲氧西林金黃色葡萄球菌感染的亞單位疫苗以及相關的檢測試劑盒。本發(fā)明專利技術(shù)采用基因工程技術(shù)重組表達此融合蛋白，不僅表達量高便于分離純化而且高效安全。動物試驗證明可有效刺激機體產(chǎn)生較高的體液免疫應答和良好的免疫保護作用。
【技術(shù)實現(xiàn)步驟摘要】
本專利技術(shù)屬于生物
，特別涉及一種耐甲氧西林金黃色葡萄球菌alpha溶血素無毒突變體與鐵表面決定蛋白(IsdB)活性片段的重組融合重組蛋白HI2，本專利技術(shù)進一步涉及該重組蛋白的制備方法及其在制備疫苗和檢測試劑盒中的應用。
技術(shù)介紹
耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(methicillin-resistantStaphylococcus aureus,MRSA)是能夠感染人體任何一個部位的革蘭陽性球菌，能導致人體產(chǎn)生廣泛的疾病，如菌血癥，心內(nèi)膜炎，毛囊炎，疔，癤，癰，膿皰病，蜂窩(組)織炎，葡萄狀菌病，毒性休克綜合癥 ，中樞系統(tǒng)感染，感染性眼部炎性疾病，骨髓炎，骨及關節(jié)感染，呼吸系統(tǒng)感染等，給人類健康帶來極大的威脅。而由于該菌的多重抗生素耐藥性使得局面更加難以控制，治療手段的選擇越來越少。免疫學手段被寄以厚望用以控制金黃色葡萄球菌尤其耐甲氧西林金黃色葡萄球的感染及傳播。免疫策略可以分為主動免疫與被動免疫，被動免疫用靶向金黃色葡萄球菌的抗體進行，主動免疫通過選擇合適的抗原促使機體產(chǎn)生免疫反應。合適的多糖及多肽都可以作為抗原構(gòu)成疫苗的有效組分。Hla是一個在大多數(shù)臨床分離株上都表達的穿孔形成毒素。它與多種疾病有關如肺炎，敗血癥關節(jié)炎及腦膿瘡等。Hla單體約33kDa,以七聚體形式發(fā)揮功能,每個單體的第110-150氨基酸互相靠攏在磷脂雙分子層上形成孔。隨后導致細胞膜破壞，胞內(nèi)離子滲出等。其毒性很強，在很低濃度情況下即可致病。因此，誘導機體產(chǎn)生高效抗Hla抗體應是控制金黃色葡萄球菌感染的一個重要方面。我們在此專利技術(shù)中將突變后無毒的Hla (H35L)作為疫苗的候選組分之一。耐甲氧西林金黃色葡萄球菌鐵離子表面決定蛋白IsdB是一種外膜蛋白抗原，IsdB不僅是MRSA —個重要外膜錨釘?shù)鞍祝贛RSA定植粘附中期重要作用，同時它也是MRSA從宿主獲得鐵的一個主要工具。IsdB蛋白為跨膜蛋白，其胞外區(qū)對應15廣277氨基酸序列(II)和338 466氨基酸序列(12)兩個結(jié)構(gòu)功能域在捕獲血紅蛋白發(fā)揮主要作用。我們在此專利技術(shù)中將12作為疫苗的另一候選組分并與Hla (H35L)融合。
技術(shù)實現(xiàn)思路
針對耐甲氧西林金黃色葡萄球菌的高耐藥性，本專利技術(shù)提供一種耐甲氧西林金黃色葡萄球菌alpha溶血素無毒突變體與鐵表面決定蛋白B活性片段的重組融合重組蛋白，其可應用于制備抗耐甲氧西林金黃色葡萄球菌感染的亞單位疫苗以及相關的檢測試劑盒。本專利技術(shù)采用基因工程技術(shù)重組表達所述融合蛋白，不僅表達量高便于分離純化而且高效安全。動物試驗證明可有效刺激機體產(chǎn)生較高的體液免疫應答和良好的免疫保護作用。重組融合蛋白由金黃色葡萄球菌alpha溶血素(Hla)與鐵表面決定蛋白B(IsdB)片段(12)組成，其中，Hla與12通過連接肽融合。所述重組融合蛋白具有Hla-Linker_I2的結(jié)構(gòu)特點，簡稱HI2 ;具有SEQ ID NO:1的DNA序列及SEQ IDNO:2的氨基酸序列。所述連接肽為Linker，該連接肽為-(Linker) n_，其中Linker為GGGGS或GGSGG或 YAPVDV, η 為 1-4，優(yōu)選 Linker 為 GGGGS, η 為 I。所述Hla為H35L的無毒突變體，其DNA序列如SEQ ID NO: 3所示，其氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示所述12為金黃色葡萄球菌鐵表面決定蛋白B膜外區(qū)第二結(jié)構(gòu)域，即第484-559位氨基酸組成的多肽，其DNA序列如SEQ ID NO:5所示，氨基酸序列如SEQ ID Ν0:6所示。上述的重組融合蛋白的制備方法蛋白， 包括以下步驟I)全基因合成(由上海捷瑞生物技術(shù)有限公司合成)以獲得編碼ΗΙ2的DNA序列并克隆到表達載體；2)將所表達載體然后轉(zhuǎn)化至宿主菌，誘導轉(zhuǎn)化后的宿主菌表達ΗΙ2重組蛋白。所述表達載體為pGex系列載體、pET系列載體,優(yōu)選為pGex_6P_2。表達上述表達載體的宿主菌。所述宿主菌為大腸桿菌XLl-blue、BL21系列或HMS174系列，優(yōu)選為大腸桿菌XLl-blue。本專利技術(shù)優(yōu)選采用pGEX-6p_2載體構(gòu)建重組表達載體，表達重組蛋白HI2，pGEX是由Smith和Johnson于1987年構(gòu)建的表達融合蛋白的載體,其主要特點是載體上接有一個分子量為26kDa的谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(GST)，所表達的融合蛋白中就含有一個GST標簽，此標簽是蛋白純化的標記。與其他融合載體相比，PGEX系列載體具有純化條件溫和、步驟簡單、不需要變性劑的加入，從而使純化后的蛋白能最大限度保持其空間構(gòu)象和免疫原性。如上所述的重組蛋白在制備抗耐甲氧西林金黃色葡萄球菌的亞單位疫苗中的應用。上述的重組蛋白在制備耐甲氧西林金黃色葡萄球菌檢測試劑盒中的應用。鑒于Hla有極強的毒性，本專利技術(shù)在其活性位點H35進行了突變，用Leu替代，即Hla(H35L)。IsdB分子較大，我們選用具有良好免疫原性的第二個結(jié)構(gòu)域IsdB (338-466)與Hla(H35L)融合，以期達到便于表達純化，具有更好的免疫原性的效果。本專利技術(shù)還提供一種宿主菌，其導入有上述構(gòu)建的重組表達載體。本專利技術(shù)采用基因工程技術(shù)克隆表達此重組融合蛋白，表達量高，便于分離純化，而且高效安全。HI2重組蛋白可直接與佐劑(如氫氧化鋁佐劑、磷酸鋁佐劑、單硬脂酸鋁佐劑、MF59、完全弗氏佐劑、完全弗氏佐劑、分枝桿菌卡介苗佐劑等)配合使用，適用于注射免疫接種。我們根據(jù)金黃色葡萄球菌基因組學及蛋白質(zhì)組學的最新成果，確定構(gòu)建基于alpha溶血素(Hla)及鐵表面決定蛋白(IsdB)的疫苗。本專利技術(shù)的基因工程重組蛋白的表達方法具有以下優(yōu)點I) HI2重組蛋白表達質(zhì)粒在原核表達系統(tǒng)一大腸桿菌中誘導表達；2)選擇pGEX載體系列時，HI2重組蛋白以融合蛋白形式表達；表達載體上接有一個分子量為26kDa的谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(GST)，所表達的融合蛋白中就含有一個GST標簽，此標簽就成為蛋白純化的標記，使得純化條件溫和、步驟簡單、不需要變性劑的加入，從而純化后的蛋白能最大限度保持其空間構(gòu)象和免疫原性；純化出來的HI2重組蛋白純度大于 95% ；3) HI2重組蛋白均能夠誘導動物產(chǎn)生特異性的抗體。利用本專利技術(shù)HI2重組蛋白制備的亞單位疫苗可通過皮下(肌肉)注射途徑進行免疫接種，激發(fā)機體產(chǎn)生高滴度IgG抗體和細胞免疫應答。并經(jīng)動物實驗證實，所述基因工程重組多價疫苗具有良好的抗MRSA感染的免疫保護效果。為進一步的聯(lián)合疫苗和多亞單位融合疫苗研究打下基礎，同時為防治疫苗和診斷試劑盒的研制及應用具有重要的作用。為了使本專利技術(shù)目的、技術(shù)方案及優(yōu)點更加清楚明白，下面結(jié)合附圖及實施例，對本專利技術(shù)進行進一步詳細說明。應當理解，此處所描述的具體實施例僅用以解釋本專利技術(shù)，并不用于限定本專利技術(shù)。附圖說明圖1為表達載體pGEX-6p-2_HI2的酶切鑒定結(jié)果·泳道1:核酸(DNA)分子量標準(Marker)；泳道2 :重組表達質(zhì)粒pGEX-6p-2_HI2經(jīng)酶切后的鑒定結(jié)果，酶切后分離的片段為4. 8kbp 和1. 3kb ；圖2HI2蛋白純化結(jié)果泳道1:蛋白分子量標準(Marker)；泳道2 GST-HI2 蛋白泳道3:經(jīng)PP酶后純化得到的HI2蛋白，該蛋白理論分子量為47. 7kD，從圖看出本文檔來自技高網(wǎng)...
【技術(shù)保護點】
一種重組融合蛋白，其特征在于：該蛋白由金黃色葡萄球菌alpha溶血素（Hla）及鐵表面決定蛋白B(IsdB)片段通過連接肽融合而成，該重組融合蛋白的DNA序列如SEQ?ID?NO:1所示，氨基酸序列如SEQ?ID?NO:2所示。
【技術(shù)特征摘要】
【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：鄒全明，樊紹文，盧陸，曾浩，馮強，左錢飛，章金勇，顧江，魯東水，
申請(專利權(quán))人：重慶原倫生物科技有限公司，中國人民解放軍第三軍醫(yī)大學，
類型：發(fā)明
國別省市：
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