本發明專利技術公開了重組融合蛋白HF2，該蛋白由金黃色葡萄球菌alpha溶血素（Hla）與纖維連接蛋白結合蛋白(FNBA)片段組成，其中，Hla與FNBA通過連接肽融合。該蛋白可應用于制備抗耐甲氧西林金黃色葡萄球菌感染的亞單位疫苗以及相關的檢測試劑盒。本發明專利技術采用基因工程技術重組表達此融合蛋白，不僅表達量高便于分離純化而且高效安全。動物試驗證明可有效刺激機體產生較高的體液免疫應答和良好的免疫保護作用。
【技術實現步驟摘要】
用于耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA)疫苗的重組蛋白 HF2及制備方法和應用
本專利技術屬于生物
，特別涉及一種耐甲氧西林金黃色葡萄球菌alpha溶血素無毒突變體與纖連蛋白結合蛋白A活性片段的重組蛋白HF2，本專利技術進一步涉及該重組蛋白的制備方法及其在制備疫苗和檢測試劑盒中的應用。
技術介紹
金黃色葡萄球菌能導致人體產生廣泛的疾病，如菌血癥，心內膜炎，毛囊炎，疔， 癤，癰，膿皰病，蜂窩(組)織炎，葡萄狀菌病，毒性休克綜合癥，中樞系統感染，感染性眼部炎性疾病，骨髓炎，骨及關節感染，呼吸系統感染等，給人類健康帶來極大的威脅。而由于該菌的多重抗生素耐藥性使得局面更加難以控制，治療手段的選擇越來越少。免疫學手段被寄以厚望用以控制金黃色葡萄球菌尤其耐甲氧西林金黃色葡萄球的感染及傳播。免疫策略可以分為主動免疫與被動免疫，被動免疫用靶向金黃色葡萄球菌的抗體進行，主動免疫通過選擇合適的抗原促使機體產生免疫反應。合適的多糖及多肽都可以作為抗原構成疫苗的有效組分。如多糖CP5，CP8被Nabi公司用作疫苗組分；蛋白IsdB 被Merck公司用作疫苗組分。Hla是一個在大多數臨床分離株上都表達的穿孔形成毒素。它與多種疾病有關如肺炎，敗血癥關節炎及腦膿瘡等。Hla單體約33kDa,以七聚體形式發揮功能,每個單體的第 110-150氨基酸互相靠攏在磷脂雙分子層上形成孔。隨后導致細胞膜破壞，胞內離子滲出等。其毒性很強，在很低濃度情況下即可致病。因此，誘導機體產生高效抗Hla抗體應是控制金黃色葡萄球菌感染的一個重要方面。我們在此專利技術中將突變后無毒的Hla (H35L)作為疫苗的候選組分之一。纖維連接蛋白結合蛋白(FNBA)是一表面相關多功能受體，特異可逆結合于人纖維連接蛋白，fibrin, fibrinogen等。該結合在機體手術及受傷情況下使細菌有效粘附，隨之侵入定植。FNBP為一 929個氨基酸約106kDa的酸性蛋白。誘導機體產生其抗體可以阻止SA粘附于人組織，進而阻止感染。由于FNBA分子量大，難于用重組工程菌進行完整蛋白的表達，我們將FNBA成熟肽第464-904氨基酸作為候選疫苗之一。
技術實現思路
針對耐甲氧西林金黃色葡萄球菌的高耐藥性，本專利技術提供一種耐甲氧西林金黃色葡萄球菌alpha溶血素無毒突變體與纖連蛋白結合蛋白A活性片段的重組融合重組蛋白， 其可應用于制備抗耐甲氧西林金黃色葡萄球菌感染的亞單位疫苗以及相關的檢測試劑盒。 本專利技術采用基因工程技術重組表達所述融合蛋白，不僅表達量高便于分離純化而且高效安全。動物試驗證明可有效刺激機體產生較高的體液免疫應答和良好的免疫保護作用。重組融合蛋白由金黃色葡萄球菌alpha溶血素(Hla)與纖維連接蛋白結合蛋白(FNBA)片段組成，其中，Hla與FNBA通過連接肽融合。所述重組融合蛋白具有Hla-Linker-FNBA的結構特點，簡稱HF2 ;具有SEQ ID NO: I的DNA序列及SEQ ID NO: 2的氨基酸序列。所述連接肽為Linker，該連接肽為-(Linker) n_，其中Linker為GGGGS或GGSGG 或 YAPVDV, η 為 1-4，優選 Linker 為 GGGGS, η 為 I。所述Hla為第110-150缺失的突變體Hla(delta 110-150)及 Hla (H35L, deltal 10-150)的金黃色葡萄球菌alpha溶血素全毒素Hla。所述Hla優選第110-150缺失的突變體Hla(H35L，deltall0-150)的金黃色葡萄球菌alpha溶血素全毒素Hla，其氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示。所述FNBA為金黃色葡萄球菌纖維連接蛋白結合蛋白膜外區，具體地指金黃色葡萄球菌纖維連接蛋白結合蛋白膜外區，其氨基酸序列如SEQ ID N0:6所示。上述的重組融合蛋白的制備方法蛋白，包括以下步驟I)全基因合成以獲得編碼Hla(H35L deltall0-150)的DNA序列；2)用核酸序列如SEQ ID N0:7及SEQ ID N0:8所示的正向和反向引物，擴增出重組融合蛋白的Hla部分；3)用核酸序列如DNA序列為SEQ ID N0:9及SEQ ID NO: 10所示的正向和反向引物，從MRSA基因組擴增出重組融合蛋白的FNBA部分；4)以Hla及FNBA做模板，用核酸序列如SEQ ID NO: 7及SEQ ID NO: 10所示的正向和反向引物擴增出重組融合蛋白HF2片段；5)將所獲得的HF2基因片段克隆至表達載體，然后轉化至宿主菌，誘導轉化后的宿主菌表達HF2重組蛋白；6)純化重組蛋白。表達HF2重組蛋白的表達載體，其包含編碼所述HF2重組蛋白的核苷酸序列SEQ ID N0:2。所述表達載體為pGex系列載體、pET系列載體,優選為pGex_6P_2。表達上述表達載體的宿主菌。所述宿主菌為大腸桿菌XLl-blue、BL21系列或 HMS174系列，本專利技術優選采用pGEX-6p-2載體來構建重組表達載體，表達重組蛋白HF2， pGEX是由Smith和Johnson于1987年構建的表達融合蛋白的載體,其主要特點是載體上接有一個分子量為26kDa的谷胱甘肽-S-轉移酶(GST)，所表達的融合蛋白中就含有一個GST 標簽，此標簽是蛋白純化的標記。與其他融合載體相比，PGEX系列載體具有純化條件溫和、 步驟簡單、不需要變性劑的加入，從而使純化后的蛋白能最大限度保持其空間構象和免疫原性。上所述的重組蛋白在制備抗耐甲氧西林金黃色葡萄球菌的亞單位疫苗中的應用。上述的重組蛋白在制備耐甲氧西林金黃色葡萄球菌檢測試劑盒中的應用。鑒于Hla有極強的毒性，本專利技術在其活性位點H35進行了突變，用Leu替代，即 Hla(H35L)。為了進一步降低Hla的分子量同時盡量原蛋白結構，本專利技術將能形成穿孔結構的第110-150位氨基酸去除，即形成Hla(H35L deltall0-150)，其氨基酸序列為SEQ ID N0:4。FnBA蛋白為兩次跨膜蛋白，其胞外區對應28_943的氨基酸序列，并且其粘附主要由胞外區的蛋白質發揮作用，為了在最大限度上保持FNBA的結構和功能不發生較大的變化，本專利技術用成熟肽第464-904氨基酸，即FNBA2，其序列為SEQ ID NO:6，與Hla(H35L deltall0-150)用短肽GGGGS連接，形成最后的融合蛋白命名HF2，其氨基酸序列為SEQ ID N0:2。因此，本專利技術還提供一種宿主菌，其導入有上述構建的重組表達載體。本專利技術采用基因工程技術克隆表達此重組融合蛋白，表達量高，便于分離純化，而且高效安全。HF2重組蛋白可直接與佐劑(如氫氧化鋁佐劑、磷酸鋁佐劑、單硬脂酸鋁佐劑、 MF59、完全弗氏佐劑、完全弗氏佐劑、分枝桿菌卡介苗佐劑等)配合使用，適用于注射免疫接種。我們根據金黃色葡萄球菌基因組學及蛋白質組學的最新成果，確定構建基于 alpha溶血素(Hla)及纖維連接蛋白結合蛋白(FNBPA)的疫苗。本專利技術的基因工程重組蛋白的表達方法具有以下優點I) HF2重組蛋白表達質粒在原核表達系統一大腸桿菌中誘導表達；2)選擇pGEX載體系列時，HF2重組蛋白以融合蛋白形式表達；表達載體上接有一個分子量為26kD本文檔來自技高網...
【技術保護點】
一種重組蛋白HF2，其特征在于：該蛋白由金黃色葡萄球菌alpha溶血素（Hla）與纖維連接蛋白結合蛋白(FNBA)片段組成，其中，Hla與FNBA通過連接肽融合。
【技術特征摘要】
1.一種重組蛋白HF2,其特征在于該蛋白由金黃色葡萄球菌alpha溶血素(Hla)與纖維連接蛋白結合蛋白(FNBA)片段組成，其中，Hla與FNBA通過連接肽融合。2.根據權利要求I所述的重組蛋白HF2，其特征在于，該重組蛋白具有SEQID NO: I所示的核酸序列及SEQ ID NO: I所示的氨基酸序列。3.根據權利要求I所述的重組蛋白HF2，其特征在于，所述連接肽為Linker，該連接肽為-(Linker) n_，其中 Linker 為 GGGGS 或 GGSGG 或 YAPVDV，η 為 1-4，優選 Linker 為 GGGGS，η為I。4.根據權利要求I所述的重組蛋白HF2，其特征在于所述Hla為第110-150缺失的突變體Hla(delta 110-150)或Hla(H35L, deltall0-150)，優選為 Hla(H35L, deltall0-150)。5.根據權利要求4述的重組蛋白HF2，其特征在于所述Hla為第110-150缺失的突變體Hla (H35L, deltal 10-150)的金黃色葡萄球菌alpha溶血素全毒素Hla，其DNA序列如SEQ ID NO:3所示，氨基酸序列如SEQ ID N0:4所示。6.根據權利要求I所述的重組蛋白HF2，其特征在于所述FNBA為金黃色葡萄球菌纖維連接蛋白結合蛋白膜外區，其DNA序列如SEQ ID NO:5所示，氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示。7....
【專利技術屬性】
技術研發人員：馮強，鄒全明，曾浩，樊紹文，盧陸，董衍東，魯東水，吳翼，蔡昌芝，
申請(專利權)人：重慶原倫生物科技有限公司，中國人民解放軍第三軍醫大學，
類型：發明
國別省市：
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