抗NKG2A 的單克隆抗體制造技術

本發明專利技術涉及一種抗NKG2A的單克隆抗體。本發明專利技術提供的單克隆抗體或其片段的特征在于：與NKG2A特異性結合；不與人類Fcγ受體IIIa特異性結合；當結合到人類NK細胞上的NKG2A時，使所述NK細胞在靶人類細胞與所述NK細胞接觸時溶解在靶細胞表面上帶有HLA-E或Qa1b的所述靶人類細胞；進一步的特征在于不與NKG2C或NKG2E特異性結合。本發明專利技術還涉及包括單克隆抗體或其片段的藥物組合物在制備用于治療患者的自身免疫性或炎性障礙的藥物中的應用。

【技術實現步驟摘要】
抗NKG2A的單克隆抗體本申請是申請日為2005年12月27日的題為“抗NKG2A的單克隆抗體”的中國專利申請No.200580045348.1的分案申請。
本專利技術涉及針對NK細胞表面受體NKG2A的單克隆抗體及其片段，以及生產和評價這樣的抗體的方法。單克隆抗體及其片段在治療免疫疾病，尤其是自身免疫性疾病以及其他要求調控NK細胞功能的疾病中是有用的?？傮w而言，本專利技術方法涉及使用抗體及其片段，以防止導致促成待治療疾病病理的表達HLA-E或Qa1b的細胞如樹突細胞或活化T細胞的溶解的NK細胞上NKG2A受體的刺激。
技術介紹
保持有效的免疫監視而不引起自身免疫反應需要效應T細胞反應的準確滴定。當免疫系統針對自身抗原發起免疫反應時便出現自身免疫性疾病(參見，例如，Ludewigetal.(1999)ImmunolRev.169：45-54)。盡管在引發和維持自身免疫性反應中涉及的機制還不清楚，但是可能涉及在次級淋巴器官中以前在免疫方面被忽視的抗原的出現。樹突細胞是骨髓來源的抗原呈遞細胞(APC)，其在免疫反應中發揮關鍵作用(參見，例如，O’Neilletal.(2004)Blood104：2235-2246)。DC通過吞噬、胞吞和胞飲作用將細菌、病毒、瀕死細胞和各種復合分子加以內化。并入的蛋白被分解為肽，它們接著與MHCI和II類分子一起被呈遞到DC細胞表面上。加載到MHCI類上的抗原通常來源于內源性蛋白并且由CD8+T細胞識別，而MHCII類加載的抗原通常來源于外源蛋白并且由CD4+T細胞識別。在抗原捕獲之后，未成熟的DC細胞變成熟而形成了成熟的DC，它們表現出減少的吞噬作用，移動到淋巴組織并且具有增強的T細胞刺激能力。在淋巴組織中，DC起動原初T細胞，刺激它們的克隆擴增和分化，并且也可以與B細胞和本身免疫系統的細胞(包括NK細胞)相互作用?；罨腘K細胞可以殺傷不成熟的DC細胞，而不是成熟的DC細胞。由于T淋巴細胞的抗原運送和初始敏化主要是通過抗原呈遞樹突細胞介導的，所以有可能通過樹突細胞自身抗原的不合適的呈遞至少部分地促進自身免疫性障礙。自然殺傷(NK)細胞是包括在非傳統免疫中涉及的淋巴細胞的亞種群。NK細胞提供一種有效的免疫監督機制，由此可消除不希望的細胞如腫瘤細胞或病毒感染的細胞。NK細胞活性是通過包含兩種活化和抑制信號的復雜機制進行調控的(參見，例如，Morettaetal.(2001)AnnuRevImmunol19：197-223；Morettaetal.(2003)EMBOJEPubDec18；Ravetchetal.(2000)Science290：84-89；Zambelloetal.(2003)Blood102：1797-805；Morettaetal.(1997)CurrOpinImmunol9：694-701；將其全部內容通過引用結合在此)。已證實多種不同的NK特異性受體在NK細胞介導的對HLAI類缺陷型靶細胞的識別和殺傷中起重要作用。這些受體(稱為NKp30、NKp46和NKp44)是Ig超家族的成員。它們的交聯(通過特異性mAb誘導)導致強烈的NK細胞激活，致使細胞內Ca++水平升高，觸發細胞毒性和淋巴因子釋放。重要的是，mAb介導的NKp30、NKp46和/或NKp44的活化導致對于多種靶細胞的NK細胞毒性的激活。這些發現為這些受體在天然細胞毒性中的一種中心性作用提供了證據。NK細胞由主要組織相容性復合物(MHC)I類-特異性抑制性受體進行負調控(etal.(1986)Nature319：675-8；Ohlenetal，(1989)Science246：666-8)。這些特異性受體與主要組織相容性復合體(MHC)I類分子或HLA的多態決定子相結合，并抑制自然殺傷(NK)細胞溶解。在人體內，稱為殺傷Ig-樣受體(KIR)的受體家族的某些成員識別HLAI類等位基因的組(參見，例如Yawataetal.(2002)CritRevImmunol22：463-82；Martinetal.(2000)Immunogenetics.51：268-80；Lanier(1998)AnnuRevImmunol.16：359-93；將其全部內容通過引用結合在此)。NK細胞上的另一重要的抑制性受體是CD94-NKG2A，其與非典型的MHCI類分子HLA-E相互作用(參見，例如Braudetal.(1998)Nature391：795-799；Leeetal.(1998)PNAS95：5199-5204；Vanceetal.(2002)PNAS99：868-873；Brooksetal.(1999)JImmunol162：305-313；Milleretal.JImmunol(2003)171：1369-75；Brooksetal.(1997)JExpMed185：795-800；VanBenedenetal.(2001)4302-4311；美國專利申請第20030095965號；將每一篇的內容都通過引證方式合并入本文中)。這些受體中的一些具有調節T細胞抗原受體-依賴性T細胞活化的閾值的能力。在罕見的抑制性受體缺乏的情況下，這些活化同工型(isoform)可能擴大T細胞效應器的功能并且促成自身免疫病理。NKG2A的氨基酸序列在哺乳動物(包括靈長類動物)中發生變化。例如，NKG2A蛋白的人類和獼猴形式共享少于90％的一致性，包括在配體結合結構域內的大約86％。對于用于調節NKG2A的療法的努力(主要用于防止炎癥)已集中在對非典型MHCI類分子、用于人類受體的HLA-E和用于小鼠受體的Qa-1b的研究上。對于細胞表面表達，這些MHC分子優選與來源于其他MHCI類分子的信號肽的肽結合。其他I類MHC分子的表達可以調控HLA-E的表達，因此，允許NK細胞在潛在的靶細胞中監控MHCI類依賴性抗原呈遞途徑的狀態。細胞表面HLA-E的水平對于針對腫瘤和病毒感染細胞的NK細胞毒性是至關重要的。用于調節HLA-E表達或功能的治療方案通常集中在利用HLA-I或HSP60肽來誘導用于防止發炎的保護狀態，致使NK細胞不被活化。美國專利公開第20030095965號披露了一種抗體3S9，其與NKG2A、NKG2C和NKG2E結合。據稱3S9引起這些受體的交聯并且伴隨著NK細胞介導的溶解的抑制。共同擁有的PCT專利公開WO2005/105849披露了一種抗體的應用，其中該抗體與NK受體(包括NKG2A)特異結合，以治療患有粒狀淋巴細胞(NK-LDGL)的NK型淋巴細胞增殖性疾病的患者。這樣的抗體抑制NK細胞活性。已證明單克隆抗體對于各種疾病的診斷和治療是非常有用的。治療用單克隆抗體可以通過不同的機制起作用。一些抗體如利妥昔(Rituxan)識別在病態細胞(例如，腫瘤細胞)表面上存在的抗原(在利妥昔的情形下的CD20)，并且通過指導免疫細胞破壞所識別的細胞而起作用。其他抗體如將托西莫(Bexxar)、Oncolym或澤娃靈(Zevalin)連接于放射性同位素、化學治療劑或毒素，導致與該抗體結合的細胞的直接殺傷。還有其他的抗體如巴利昔單抗(Basiliximab)和達利珠單抗(Daclizumab)(它們封閉IL本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種選自由Fab、Fab’、Fab’?SH、F(ab’)2、Fv片段、雙抗體和單鏈抗體組成的組的單克隆抗體或其片段，其特征在于：a.與NKG2A特異性結合；b.不與人類Fcγ受體IIIa特異性結合；c.當結合到人類NK細胞上的NKG2A時，使所述NK細胞在靶人類細胞與所述NK細胞接觸時溶解在靶細胞表面上帶有HLA?E或Qa1b的所述靶人類細胞；并且d.進一步的特征在于不與NKG2C或NKG2E特異性結合。

【技術特征摘要】
2004.12.28 US 60/639,832;2004.12.28 US 60/639,4651.一種藥物組合物在制備用于治療患者的癌癥的藥物中的應用，所述癌癥的特征為存在表達HLA-E的癌細胞，所述藥物組合物包括單克隆抗體或其片段，所述單克隆抗體或其片段的特征在于以下各項：a.與NKG2A特異性結合；b.不與人類Fcγ受體IIIa特異性結合；以及c.當結合到人類NK細胞上的NKG2A時，使所述NK細胞在靶人類細胞與所述NK細胞接觸時溶解在靶細胞表面上帶有HLA-E或Qa1b的所述靶人類細胞，其中所述抗體包括可變重鏈區和可變輕鏈區，所述可變重鏈區包括SEQIDNO:2的氨基酸序列的三個互補決定區(CDR)，所述可變輕鏈區包括SEQIDNO:6的氨基酸序列的三個互補決定區(CDR)。2.根據權利要求1所述的應用，其中，所述單克隆抗體或其片段的進一步特征在于，不與NKG2C或NKG2E特異性結合。3.根據權利要求1或2所述的應用，其中，所述單克隆抗體或其片段的進一步特征在于，防止...

【專利技術屬性】
技術研發人員：阿萊斯山德羅·莫雷塔，埃馬努埃拉·馬爾切納羅，弗朗索瓦·羅馬涅，帕斯卡萊·安德烈，
申請(專利權)人：依奈特制藥公司，熱那亞大學，
類型：發明
國別省市：