紫花苜蓿抗旱相關基因及其編碼的蛋白和應用制造技術

本發明專利技術公開了一種由紫花苜蓿抗旱相關基因編碼的蛋白，其中，該蛋白具有SEQ?ID?No：2所示的氨基酸序列，或者該蛋白具有將SEQ?ID?No：2所示的氨基酸序列經過一個或幾個氨基酸殘基的取代、缺失或添加后仍具有抗旱活性的氨基酸序列。本發明專利技術還涉及該蛋白的編碼基因，以及含有該基因的表達載體和細胞，同時還涉及一種培育抗旱紫花苜蓿的方法和它們的應用。本發明專利技術提供的紫花苜蓿抗旱相關基因(bZIP)在紫花苜蓿中的表達可以顯著增強紫花苜蓿的抗旱性能。該基因的發現為主要農作物的抗旱研究提供了基因資源，在基因工程改良植物的抗旱性能研究中將發揮重要作用。

【技術實現步驟摘要】

本專利技術涉及一種紫花苜蓿抗旱相關基因，還涉及由該基因編碼的蛋白，以及含有所述紫花苜蓿抗旱相關基因的表達載體和細胞，同時還涉及一種培育抗旱紫花苜蓿的方法，以及紫花苜蓿抗旱相關基因及其編碼的蛋白和含有該基因的表達載體及細胞在培育抗旱能力提高的植物中的應用。
技術介紹
紫花苜蓿是我國乃至世界上最重要的豆科牧草，被譽為“牧草之王”。紫花苜蓿在中國西北地區種植較多，而西北地區干旱、少雨的氣候特點，對作物的正常生長發育非常不利，嚴重制約了農牧業的發展。因此，深入研究紫花苜蓿的抗旱性，對于克服該地區干旱、風蝕等自然條件對苜蓿栽培的制約，擴大其種植范圍，提高生產力，具有舉足輕重的意義。在過去的幾十年里對紫花苜蓿的抗旱性研究逐步從抗旱性的鑒定方面的研究轉移到提高紫花苜蓿自身抗旱性的研究上來，尤其在近幾年或是近十幾年中的研究，紫花苜蓿的抗旱性育種以及品種改良方面的研究工作尤為突出。目前最為有效的和常用的方法還是傳統的輪回選擇法，即通過在原始群體中選株產生后代，對后代進行鑒定，再用優良的后代重組形成新的群體以提高群體的平均表現。然后可以利用系譜法對新的群體選擇自交系。隨著分子生物學的發展，生物技術在育種中得到了廣泛地應用。但與其他作物(如玉米、高粱等)中的研究相比，在紫花苜蓿抗旱育種中的研究還相對較少。因此，紫花苜蓿抗旱相關的分子生物學機制還有待于進一歩的研究。
技術實現思路
本專利技術基于對紫花苜蓿抗旱相關的分子生物學機制的研究，一方面提供了紫花苜蓿抗旱相關基因及該基因編碼的蛋白，另ー方面還提供了含有所述紫花苜蓿抗旱相關基因的表達載體和細胞，以及培育抗旱紫花苜蓿的方法，還提供了它們的應用。本專利技術提供了一種紫花苜蓿抗旱相關基因編碼的蛋白，其中，該蛋白具有SEQ IDNo :2所示的氨基酸序列，或者該蛋白具有將SEQ ID No :2所示的氨基酸序列經過ー個或幾個氨基酸殘基的取代、缺失或添加后仍具有抗旱活性的氨基酸序列。本專利技術還提供了一種紫花苜蓿抗旱相關基因，其中，該基因具有SEQ IDNo 1所示的核苷酸序列，或者該基因具有編碼SEQ ID No :2所示的氨基酸序列的核苷酸序列。本專利技術還提供了ー種表達載體，其中，該表達載體含有本專利技術提供的紫花苜蓿抗旱相關基因。本專利技術還提供了ー種轉基因細胞，其中，該轉基因細胞含有本專利技術提供的紫花苜蓿抗旱相關基因。本專利技術還提供了一種培育抗旱紫花苜蓿的方法，其中，該方法包括將本專利技術提供的紫花苜蓿抗旱相關基因導入到紫花苜蓿細胞中，得到抗旱能力提高的紫花苜蓿細胞及轉基因植株。本專利技術還提供了本專利技術提供的紫花苜蓿抗旱相關基因、及其編碼的蛋白、含有所述基因的表達載體、含有所述基因的轉基因細胞在培育抗旱能力提高的植物中的應用。本專利技術提供的紫花苜蓿抗旱相關基因(bZIP)在紫花苜蓿中被干旱逆境誘導表達，進而本專利技術的專利技術人通過轉基因技術將紫花苜蓿抗旱相關基因(bZIP)導入到紫花苜蓿中，結果表明紫花苜蓿抗旱相關基因(bZIP)在紫花苜蓿中的表達可以顯著增強紫花苜蓿的抗旱性能。本專利技術從紫花苜蓿中克隆的抗旱基因為主要農作物(特別是紫花苜蓿)的抗旱研究提供了基因資源，在基因工程改良植物的抗旱性能研究中將發揮重要作用。附圖說明圖1顯示了 bZIP基因(SEQ ID NO 1)的實時定量PCR的分析結果，結果顯示bZIP基因的表達水平能夠被干旱脅迫所誘導提高。圖2顯示了實施例2中進行細胞定位所用的插入有bZIP基因的pCAMBIA1302載體的結構。圖3為將不含有目的bZIP基因的空表達載體轉入到洋蔥表皮細胞中，觀察到的亞細胞定位圖。圖4為將含有ZIP基因(SEQ ID NO 1)的表達載體轉入到洋蔥表皮細胞中，觀察到的亞細胞定位圖。 圖5顯示了實施例3中對紫花苜蓿植株進行農桿菌介導的bZIP基因轉化所用的插入有bZIP基因的pCAMBIA1302載體的結構。具體實施例方式本專利技術提供了一種由紫花苜蓿抗旱相關基因編碼的蛋白，其中，該蛋白具有SEQID No :2所示的氨基酸序列，或者該蛋白具有將SEQ ID No :2所示的氨基酸序列經過ー個或幾個氨基酸殘基的取代、缺失或添加后仍具有抗旱活性的氨基酸序列。優選情況下，該蛋白具有SEQ ID No 2所不的氣基酸序列。相應地，本專利技術還提供了一種紫花苜蓿抗旱相關基因(bZIP)，其中，該基因具有SEQ ID No :1所示的核苷酸序列，或者該基因具有編碼SEQ IDNo :2所示的氨基酸序列的核苷酸序列。優選地，該基因具有SEQ ID No :1所示的核苷酸序列。本專利技術提供的紫花苜蓿抗旱相關基因(bZIP)是專利技術人通過構建紫花苜蓿干旱脅迫下特異表達的cDNA文庫，并從該cDNA文庫中篩選得到的。所述cDNA文庫的構建方法包括利用30% (w/v)PEG8000對紫花苜蓿(Medicagosativa L. cv.保定苜蓿，北京中畜東方草業科技有限責任公司)進行模擬干旱處理12個小時，收獲植株，放于_80°C作為實驗組。沒有經過干旱處理的植株為對照組。利用PCR-Selected cDNA Subtraction Kit (Clontech, Mountain View, CA, USA)構建了紫花苜蓿干旱脅迫下特異表達的cDNA文庫。在文庫的構建過程中，獲得了 525個單菌落并全部進行測序。經過去除載體序列和冗余序列，最終獲得了 130條EST序列。這些序列的大小從250bp到lOOObp。其中，長度為567bp的EST序列引起了實驗者的關注，并對利用SMARTer RACE cDNA AmplificationKit(Clontech，USA)分別對該EST序列進行了 5’ RACE和3’ RACE克隆，最后獲得了該基因全長序列(SEQ IDNO :2)。其中，基因克隆的方法為分子生物學領域的常規實驗操作，具體方法如下A.準備基本液體2· Ομ I 5Χ 第一鏈緩沖液，1·0μ I DTT (20mM),1. O μ IdNTPMix(IOmM)；B.制備用于 5’ RACE 的 cDNA:2.75yl RNA,1. O μ I 5’ -CDS 弓丨物A (ACGCGACGGTTTCAACATCCCTCTC)；制備用于3’ RACE 的 cDNA:3.75yl RNA,1. O μ I 3’ -CDS 弓丨物A(GAGCTGATGCTGTGGCTGCTGGTTG)；C.將準備好的液體放于72°C 3分鐘，再放于42°C冷卻2分鐘。D.向 B 中 5’ RACE 的 cDNA 中加入 I μ I 的 SMARTer IIA oligo。E.制備5’ RACE和3’ RACE的cDNA反應液4. O μ I的步驟A得到的緩沖液，0. 25 μ IRNA 酶抑制劑(40U/ μ I)，1. O μ I SMARTScribe 逆轉錄酶(100U)。F.將步驟E中的液體加入到步驟C中，完成3’ RACE的cDNA合成反應液的制備；將步驟E中的液體加入到步驟D中，完成5’ RACE的cDNA合成反應液的制備。G.將制備好的反應液放于42°C中90分鐘，最后70°C中10分鐘，完成cDNA的合成。其中，3’ RACE反應體系為94°C 30秒，68°C 30秒，72°C 3分本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種由紫花苜蓿抗旱相關基因編碼的蛋白，其特征在于，該蛋白具有SEQ?ID?No：2所示的氨基酸序列，或者該蛋白具有將SEQ?ID?No：2所示的氨基酸序列經過一個或幾個氨基酸殘基的取代、缺失或添加后仍具有抗旱活性的氨基酸序列。

【技術特征摘要】
1.一種由紫花苜蓿抗旱相關基因編碼的蛋白，其特征在于，該蛋白具有SEQ ID No2所示的氨基酸序列，或者該蛋白具有將SEQ ID No :2所示的氨基酸序列經過一個或幾個氨基酸殘基的取代、缺失或添加后仍具有抗旱活性的氨基酸序列。2.根據權利要求1所述的蛋白，其中，該蛋白具有SEQID No :2所示的氨基酸序列。3.一種紫花苜蓿抗旱相關基因，其特征在于，該基因具有SEQ ID No :1所示的核苷酸序列，或者該基因具有編碼SEQ ID No :2所不的氣基酸序列的核昔酸序列。4.根據權利要求3所述的基因，其中，該基因具有SEQID No :1所示的核...

【專利技術屬性】
技術研發人員：王涌鑫，鄭彥，劉濤，張路培，苗麗宏，李聰，
申請(專利權)人：中國農業科學院北京畜牧獸醫研究所，
類型：發明
國別省市：