本發(fā)明專利技術(shù)公開了一種羅非魚激活素受體ⅡB細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域基因片段。所述基因片段是以羅非魚肌肉總RNA為模板，經(jīng)RT-PCR和RACE方法而得到的羅非魚激活素受體IIB基因，將羅非魚激活素受體IIB基因克隆到載體pCR2.1中得到克隆載體pCR2.1-ActRIIB；以載體pCR2.1-ActRIIB為模板，設(shè)計羅非魚激活素受體ⅡB細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域基因片段引物F和R，經(jīng)PCR反應(yīng)得到細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域基因片段；本發(fā)明專利技術(shù)還公開了一種含有羅非魚激活素受體ⅡB細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域基因片段的表達(dá)載體pQE30-ActRIIB，將表達(dá)載體pQE30-ActRIIB導(dǎo)入大腸桿菌中進(jìn)行表達(dá)獲得羅非魚激活素受體ⅡB重組蛋白，該蛋白可以應(yīng)用于魚苗苗種促生長劑或添加劑的制備。
【技術(shù)實現(xiàn)步驟摘要】
本專利技術(shù)屬于基因工程
，具體地，涉及一種羅非魚激活素受體IIB重組蛋白的制備方法及其應(yīng)用。
技術(shù)介紹
激活素(activin)屬于轉(zhuǎn)化生長因子β (TGF-β)超家族成員，是一類具有多種功能的生長和分化因子，具有調(diào)節(jié)垂體分泌卵泡刺激素(FSH)、促進(jìn)紅細(xì)胞系的分化等作用。激活素通過與靶細(xì)胞膜上的受體結(jié)合而傳遞信號，其受體分為兩種類型即I型(ActRI)和II 型(ActR II )。激活素受體ActR (activin receptor)屬于單次跨膜絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶家族，由胞外結(jié)構(gòu)域，跨膜結(jié)構(gòu)域和胞內(nèi)激酶結(jié)構(gòu)域三部分組成。從AtT20細(xì)胞克隆的受體命名為激活素II型受體，目前在脊椎動物中發(fā)現(xiàn)兩種激活素II型受體的存在，如ActRIIA或ACVR2，第二種激活素受體ActRIIB，或者稱為ACVR2B。II型受體需要和I型受體結(jié)合形成二聚體才能發(fā)揮作用，I型受體招募并磷酸化受體調(diào)控的SMAD (R-SMAD), R-SMAD轉(zhuǎn)位到細(xì)胞核中發(fā)揮轉(zhuǎn)錄因子的作用。ActRIIB有多種配體,如Myostatin通過與其結(jié)合調(diào)節(jié)肌肉生長。Myostatin，屬TGF-beta超家族成員，是公認(rèn)的肌肉生長的負(fù)調(diào)控因子。阻斷Myostatin-ActRIIB-RSMAD途徑對調(diào)控肌肉生長有重要意義。在小鼠，牛，狗等哺乳動物和金魚等硬骨魚中對該途徑進(jìn)行調(diào)控收到良好的臨床上和生產(chǎn)上良好的效果。羅非魚(Tilapia)，隸屬于鱸形目、鱸形亞目、麗魚科、羅非魚屬。目前被養(yǎng)殖的有15種，生長迅速，尤以幼魚期生長更快。中國現(xiàn)已成為最大的羅非魚生產(chǎn)國，截至2008年，我國羅非魚產(chǎn)量占全球產(chǎn)量的49%。全球范圍內(nèi)對羅非魚的需求仍在增加，使羅非魚產(chǎn)量更快地增長是解決這一狀 況的關(guān)鍵。
技術(shù)實現(xiàn)思路
本專利技術(shù)所要解決的技術(shù)問題是為了滿足羅非魚需求的快速增長，公開了一種羅非魚激活素受體IIB細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域基因片段。本專利技術(shù)的另一個目的是公開了一種羅非魚激活素受體IIB蛋白的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域。本專利技術(shù)的另一個目的是公開了一種羅非魚激活素受體IIB基因。本專利技術(shù)的另一個目的是公開了一種羅非魚激活素受體IIB蛋白。本專利技術(shù)的另一個目的是公開了擴(kuò)增羅非魚激活素受體IIB基因片段的引物。本專利技術(shù)的另一個目的是公開了一種含有羅非魚激活素受體IIB細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域基因片段或羅非魚激活素受體IIB基因的載體。本專利技術(shù)的另一個目的是公開了一種羅非魚激活素受體IIB重組蛋白的制備方法。本專利技術(shù)的另一個目的是公開了一種羅非魚激活素受體IIB重組蛋白在制備魚苗苗種促生長劑或添加劑中的應(yīng)用。為了實現(xiàn)上述目的，本專利技術(shù)是通過以下技術(shù)予以實現(xiàn)的一種羅非魚激活素受體IIB細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域基因片段，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所/Jn ο一種羅非魚激活素受體IIB蛋白的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域，其編碼蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:2 所示。一種羅非魚激活素受體IIB基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示。一種羅非魚激活素受體IIB蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO: 4所示。一對用于擴(kuò)增羅非魚激活素受體IIB基因片段引物，引物可以為F和R，其引物序列如SEQ ID NO: 5 6所示；或者引物為F7和R7，其序列如SEQ ID NO: 7 8所示；序列如SEQID NO: 5^6所示引物F和R是用于擴(kuò)增羅非魚激活素受體IIB細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域基因片段；序列如SEQ ID N0:7 8所示引物F7和R7是用于擴(kuò)增羅非魚激活素受體IIB基因的。進(jìn)一步地，所述引物F含有KpnI內(nèi)切酶位點，引物R含有終止密碼子和HindIII內(nèi)切酶位點。一種載體，所述載體包含SEQ ID NO:1或SEQ ID N0:3的基因片段。針對SEQ IDNO:1片段，該載體為大腸桿菌克隆載體pCR2.1-ActRIIB ;針對SEQ ID N0:3片段，載體為大腸桿菌表達(dá)載體pQE30- ActRIIB。進(jìn)一步地，本專利技術(shù)提供了一種重組株，是由上述載體(表達(dá)載體)6轉(zhuǎn)入大腸桿菌中所得。優(yōu)選地，是上述 獲得的表達(dá)載體PQE30- ActRIIB轉(zhuǎn)入大腸桿菌M15中所形成的大腸桿菌重組株 PQE30- ActRIIB-M15。進(jìn)一步地，本專利技術(shù)公開了一種羅非魚激活素受體IIB重組蛋白的制備方法，包括如下步驟 51.將權(quán)利要求6或7所述表達(dá)載體轉(zhuǎn)入大腸桿菌中，利用氨芐青霉素抗性基因篩選陽性轉(zhuǎn)化子； 52.將陽性轉(zhuǎn)化子接種在含有氨芐青霉素的液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)過夜，次日接種于相同培養(yǎng)基中，并經(jīng)IPTG誘導(dǎo)，培養(yǎng)后收集菌體，經(jīng)分離純化得到重組羅非魚激活素受體IIB。優(yōu)選地，制備方法如下 51.將所述表達(dá)載體PQE30-ActRIIB轉(zhuǎn)入大腸桿菌M15中，利用氨芐青霉素抗性基因篩選陽性轉(zhuǎn)化子PQE30- ActRIIB-M15 ； 52.將陽性轉(zhuǎn)化子pQE30-ActRIIB-M15接種在含有氨芐青霉素的液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)過夜，次日接種于相同培養(yǎng)基中，并經(jīng)IPTG誘導(dǎo)，培養(yǎng)后收集菌體，經(jīng)分離純化得到重組羅非魚激活素受體IIB。更優(yōu)選地，步驟S2為將陽性轉(zhuǎn)化子pQE30- ActRIIB-Ml5接種在含有氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中，370C，200轉(zhuǎn)/分培養(yǎng)過夜，次日接種于相同培養(yǎng)基中，并經(jīng)IPTG誘導(dǎo)，37°C，200轉(zhuǎn)/分培養(yǎng)，10小時后收集菌體，經(jīng)分離純化得到重組羅非魚激活素受體IIB。更優(yōu)選的，步驟S2中所述IPTG的誘導(dǎo)濃度為lmmol/L。一種如上所述羅非魚激活素受體IIB重組蛋白在制備魚苗苗種促生長劑或添加劑中的應(yīng)用。氨基酸序列分析表明羅非魚激活素受體IIB成熟肽是羅非魚激活素受體IIB原切除信號肽后的一個片段，既羅非魚激活素受體IIB原第22位以后的氨基酸序列，而羅非魚激活素受體IIB的胞外結(jié)構(gòu)域則相當(dāng)于23至134位氨基酸。游離形式的羅非魚激活素受體IIB的胞外結(jié)構(gòu)域能夠與膜結(jié)合的受體競爭結(jié)合Myostatin等配體,進(jìn)而發(fā)揮其促生長活性；本專利技術(shù)的羅非魚激活素受體IIB全長基因是以激活素受體IIB羅非魚肌肉總RNA反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA為模板，經(jīng)PCR和RACE方法擴(kuò)增而得到的。總的來說，本專利技術(shù)用于表達(dá)羅非魚ActRIIB胞外區(qū)重組蛋白的基因序列是以羅非魚激活素受體IIB全長基因雙鏈DNA為模板，經(jīng)PCR方法擴(kuò)增而得到的，它來源于羅非魚激活素受體IIB胞外結(jié)構(gòu)域所對應(yīng)的基因片段。按照上述的羅非魚ActRIIB重組蛋白的基因序列，它正好是羅非魚激活素受體IIB全長基因67bp至402bp (相當(dāng)于23位至134位氨基酸)的胞外區(qū)段，其核苷酸序列及其所編碼的氨基酸序列如序列表所示。本專利技術(shù)還構(gòu)建了含有上述羅非魚ActRIIB胞外區(qū)重組蛋白的基因序列的載體；特別是含有該基因的大腸桿菌克隆載體以及表達(dá)載體。這些載體的構(gòu)建方法是按常規(guī)方法，將通過PCR方法合成的羅非魚激活素受體IIB基因經(jīng)酶切和分離純化后，接入到已有的相應(yīng)載體的相應(yīng)酶切位點(即Kpn I取HindIID之間，即構(gòu)建成所需的含有羅非魚激活素受體IIB基因的表達(dá)載體。上述含羅非魚 激活素受體IIB基因的大腸桿菌表達(dá)載體優(yōu)選由本專利技術(shù)合成的羅非魚激活素受體IIB基因與大腸桿菌表達(dá)載體pQE30構(gòu)建成的重組表達(dá)載體，命名為pQE30- ActRIIB本文檔來自技高網(wǎng)...
【技術(shù)保護(hù)點】
一種羅非魚激活素受體IIB細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域基因片段，其特征在于核苷酸序列如SEQ?ID?NO:1所示。
【技術(shù)特征摘要】
1.一種羅非魚激活素受體IIB細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域基因片段，其特征在于核苷酸序列如SEQID NO:1 所示。2.一種羅非魚激活素受體IIB蛋白細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域，其特征在于氨基酸序列如SEQ IDNO: 2所示。3.一種羅非魚激活素受體IIB基因，其特征在于核苷酸序列如SEQ ID N0:3所示。4.一種羅非魚激活素受體IIB蛋白，其特征在于氨基酸序列如SEQ ID NO: 4所示。5.一對用于擴(kuò)增羅非魚激活素受體IIB基因片段引物，其特征在于引物序列如SEQ IDNO:5 6所示；或者引物序列如SEQ ID N0:7 8所示。6.一種載體，其特征在于含有權(quán)利要求1或3所述的基因片段。7.根據(jù)權(quán)利要求6所述載體，其特征在于，所述載體為大...
【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：李文笙，鄺中雷，
申請(專利權(quán))人：中山大學(xué)，
類型：發(fā)明
國別省市：
還沒有人留言評論。發(fā)表了對其他瀏覽者有用的留言會獲得科技券。