本發明專利技術公開了一種結晶樣先天性白內障致病基因CRYGD檢測試劑盒，涉及基因檢測盒。一種結晶樣先天性白內障致病基因CRYGD檢測試劑盒，由AS-PCR擴增檢測試劑組成，所述的AS-PCR擴增檢測試劑由10×PCRbuffer2μl；dNTP混合物0.5μl；10μmol/L的AS-PCR特異性上下游引物和內參的上下游引物各0.5μl；2U/ul的TaqDNA聚合酶0.5μl；去離子水13μl組成。本發明專利技術對患者血液中提取的DNA組直接對CRYGD基因P23T點突變進行檢測，能夠精確地診斷結晶樣先天性白內障，從而降低漏檢率，并能與其他先天性白內障進行鑒別。
【技術實現步驟摘要】
本專利技術涉及基因檢測盒，具體涉及一種結晶樣先天性白內障致病基因CRYGD檢測試劑盒。
技術介紹
先天性白內障是胎兒發育過程中晶狀體代謝異常導致的不同程度、不同形式的晶狀體混濁，不僅使視網膜成像模糊，而且阻止視通路的發育，是目前兒童低視力和致盲的主要病因。該病的發病率約為O. 5%,占兒童致盲性眼病的第二位。先天性白內障致病因素中有1/3與遺傳相關，遺傳方式包括常染色體顯性遺傳、常染色體隱性遺傳和X連鎖遺傳三種類型。致病基因篩查是探索疾病分子發病機制的重要步驟。目前研究發現39個位點、17個基因與先天性白內障相關。包括晶狀體蛋白基因，膜蛋白基因即縫隙連接蛋白基因和主要內源性膜蛋白基因，念珠狀纖絲蛋白基因，鐵蛋白輕鏈基因以及轉錄調節因子基因。人晶狀體內90%可溶性蛋白為晶狀體蛋白，分別為α晶狀體蛋白(40%)，β晶狀體蛋白(35%)和Y晶狀體蛋白(25%)，由三類晶狀體蛋白基因α、β、Υ編碼。CRYG編碼的Y晶狀體蛋白在人晶狀體中具有較高的濃度和屈光指數，Y晶狀體蛋白在晶狀體纖維細胞內大量表達并且只表達于己分化的晶狀體纖維細胞，而在晶狀體上皮細胞內無表達，因此，它對晶狀體發育與維持其透明性具有重要作用。Y晶狀體蛋白結構較為穩定，其中Y C、Y D、Y S晶狀體蛋白分別由CRYGC、CRYGD, CRYGS基因編碼。在己知先天性白內障致病侯選基因研究中發現，晶狀體蛋白基因突變后不僅能造成晶狀體蛋白結構的異常而影響其緊密排列，還會降低晶狀體蛋白溶解性而導致混濁的形成。目前已發現幾種基因突變，如CRYAB (D140N)與雙層板層白內障相關，CRYBB2 (W151C)與中央核性白內障相關，C RYGC (Τ5Ρ)與中央粉塵狀白內障相關，CRYGD (R14C)與點狀進行性白內障相關，CRYGS (G18V)與多形態皮質性白內障相關。由于遺傳性先天性白內障具有非常顯著的遺傳異質性，不同的基因突變可導致相同表型的白內障，不同表型的白內障可由相同的基因突變造成。導致先天性白內障的臨床癥狀及實驗室檢測指征具有多樣性，因此有必要對白內障的各種臨床類型，尤其是尚未發現相關的分子生物學基礎的臨床類型進行研究，并根據該變異建立起方便、快速和準確的檢測方法，用于先天性白內障的診斷。在已知的報道中，結晶樣先天性白內障致病基因CRYGD基因第二個外顯子中第70位堿基發生C—>A置換改變，導致第23位的脯氨酸改變為蘇氨酸(P23T)，使Y晶狀體蛋白結構的改變，引起白內障的發生，但是目前還沒有較好的方法對其進行定位和檢測。
技術實現思路
本專利技術的目的是為了對結晶樣先天性白內障致病基因CRYGD進行檢測，從而提供了一種結晶樣先天性白內障致病基因CRYGD檢測試劑盒。一種結晶樣先天性白內障致病基因CRYGD檢測試劑盒，由AS-PCR擴增檢測試劑組成，所述的AS-PCR擴增檢測試劑由10XPCR buffer 2ul ;dNTP混合物O. 5ul ；10 umol/L的AS-PCR特異性上下游引物和內參的上下游引物各O. 5ul ；2 U/ul的Taq DNA聚合酶O. 5ul ；去離子水13ul組成。進一步地，所述的正向特異性引物序列為5’ -GAATGCAGCAGCGACCACA-3’，反向特異性引物序列為:5，-GGGTCCTGACTTGAGGATGT-3’。上述結晶樣先天性白內障致病基因CRYGD檢測試劑盒的使用方法，使用時，將目標基因組DNA 150 ng加入所述的試劑盒中，95°C預變性5 min，95°C變性30 S，55°C退火30 S，72°C延伸10 min，共32個循環，然后將擴增產物在I %瓊脂糖凝膠上120 V恒壓電泳lOmin，再按照常規方法檢測，即可對結晶樣先天性白內障致病基因CRYGD第二個外顯子中第70位堿基發生C—>A (P23T)點突變進行定位和檢測。進一步地，將擴增產物在2 %瓊脂糖凝膠上120 V恒壓電泳20min。本專利技術結晶樣先天性白內障致病基因CRYGD檢測試劑盒的檢測對象為結晶樣先天性白內障致病基因CRYGD，結晶樣先天性白內障致病基因CRYGD的序列見序列表，經過100例臨床試驗，檢測準確率高達99. 9%。與現有技術相比，利用本專利技術公開的結晶樣先天性白內障致病基因CRYGD檢測試劑盒及其使用方法，對患者血液中提取的DNA組直接對CRYGD基因P23T點突變進行檢測，能夠精確地診斷結晶樣先天性白內障，從而降低漏檢率，并能與其他先天性白內障進行鑒別。附圖說明圖1 :患者眼部檢查 表型為晶狀體核性結晶樣混濁。圖2 :收集的家系圖，符合常染色體顯性遺傳；圖中方形圖標表示男性，圓形圖標表示女性，空白圖形表示正常人，黑色填充圖形表示患者，打斜線圖形表示去世。圖3 :D2S325連鎖分析圖；圖中方形圖標表示男性，圓形圖標表示女性，空白圖形表示正常人，黑色填充圖形表示患者，打斜線圖形表示去世。圖4 :CRYGC和CRYGD附近的微衛星標記D2S2358進行的PAGE圖。圖5 :家系圖及單倍體構建圖。圖6 =CRYGD基因C70A (P23T)突變序列測序圖；圖中箭頭為錯義突變所在位置。圖7 =CRYGD基因正常序列測序圖；圖中箭頭為該位置正常序列。圖8 =AS-PCR產物凝膠電泳圖；M代表DNA分子量Marker，箭頭代表患者，其余為正常人，患者同時擴增出227Kb和530bp兩個產物，而正常人只有參照產物530bp。具體實施例方式經過山西省眼科醫院倫理委員會的批準，在嚴格遵守赫爾辛基宣言的前提下，本研究收集山西省榆社縣一個四代先天性結晶樣混濁白內障家系共22例成員，其中患者10例。對家系所有成員進行全面檢查，美多麗滴眼液散瞳后經裂隙燈和檢眼鏡檢查確定臨床表型，對患者眼部圖像進行數碼采集。患者眼部檢查表型均為晶狀體核性結晶樣混濁，混濁程度相似，形態一致。患者晶狀體內可見點簇狀灰白色混濁，中央混濁較為密集，向周邊部放散。部分患者伴有繼發性外斜視，不合并其他眼部及全身疾病。經受檢者知情同意，采集其中17例家系成員的外周靜脈血5ml。該家系共有22個家系成員，10名患者。每代都有患者，為垂直遺傳，男女皆可患病，符合單基因常染色體顯性遺傳特點。圖1為患者眼部檢查表型，為晶狀體核性結晶樣混濁；圖為所收集的家系圖，符合常染色體顯性遺傳，其中方形圖標表示男性，圓形圖標表示女性，空白圖形表示正常人，黑色填充圖形表示患者，打斜線圖形表示去世。實施I對致病基因進行染色體定位1、基因組DNA的提取 采用標準飽和酚/氯仿抽提法提取全血基因組DNA。2、連鎖分析(I)微衛星標記位點的選擇分別選取與17個已知ADCC致病基因距離5Mb范圍內的22對多態性微衛星遺傳標記，每個ADCC候選基因及其周圍微衛星標記的物理距離如表I所/Jn ο表1:17個已知ADCC致病基因及其`附近微衛星標記的物理距離本文檔來自技高網...
【技術保護點】
一種結晶樣先天性白內障致病基因CRYGD檢測試劑盒，其特征是由AS?PCR擴增檢測試劑組成，所述的AS?PCR擴增檢測試劑由?10×PCR?buffer?2ul；dNTP混合物0.5ul；10?umol/L的AS?PCR特異性上下游引物和內參的上下游引物各0.5ul；2?U/ul的Taq?DNA?聚合酶0.5ul；去離子水13ul組成。
【技術特征摘要】
1.一種結晶樣先天性白內障致病基因CRYGD檢測試劑盒，其特征是由AS-PCR擴增檢測試劑組成，所述的AS-PCR擴增檢測試劑由IOXPCR buffer 2ul ;dNTP混合物O. 5ul ；10umol/L的AS-PCR特異性上下游引物和內參的上下游引物各O. 5ul ;2 U/ul的T...
【專利技術屬性】
技術研發人員：張素華，張哲，賈亞丁，張曉慧，
申請(專利權)人：山西省眼科醫院，
類型：發明
國別省市：
還沒有人留言評論。發表了對其他瀏覽者有用的留言會獲得科技券。