本發明專利技術公開了一種檢測植物產生免疫反應的方法，保持現有原核表達產物表達純化及胼胝質和活性氧觀察方法不變，采用稻瘟病菌蛋白基因的原核表達產物，按照5.0mg/ml濃度處理水稻持有不同抗性基因的24個水稻單基因系品種及根組織和葉鞘；24小時后進行DAB染色和苯胺藍染色，熒光顯微鏡直接觀察胼胝質和活性氧的形成情況，通過胼胝質和活性氧的形成情況判斷植物是否產生免疫反應，該方法利用純化的效應蛋白基因的原核表達產物處理水稻根組織，通過熒光顯微鏡觀察根組織胼胝質和活性氧產生，能直接獲得水稻產生免疫反應情況，同時獲得能引起多個持有不同抗性基因的水稻單基因系品種和感病品種產生免疫反應的稻瘟病菌蛋白。
【技術實現步驟摘要】
本專利技術屬于植物保護和生物
，尤其涉及。
技術介紹
植物自身的先天免疫機制能有效抵御致病微生物的入侵。當感病植物受到病原菌特異小種侵染時，植物自身的免疫機制不能被激活，最終導致病害發生。植物通常通過兩套防御機制抵御病原微生物入侵，第一套是通用機制，第二套是抵御病原菌特異小種的機制。植物通用防御機制是病原相關分子模式激發的免疫機制，即PTI (PAMP-triggeredimmunity) 0 PTI是通過寄主胞外表面受體識別病原相關分子模式而激活，是發生在寄主與病原菌互作早期的免疫反應。植物對病原相關分子模式的識別可引發寄主一系列的生理反應，諸如①H+、K+、C1+和Ca2+離子流的產生，其中Ca2+離子流增加是植物免疫反應關鍵的一步；②活性氧爆發；③從絲裂原活化蛋白激酶(MAPKs)到防御相關基因表達，MAPKs參與了植物防御反應。在PTI過程中，MAPK聯級的激活使得WRKY型的轉錄因子表達，而這類轉錄因子是植物防御反應的關鍵調控因子；④胼胝質產生，細胞壁與細胞膜間沉積的胼胝質是PTI響應時的一個典型標志；⑤荷爾蒙，SA、JA和ET是防御反應過程中比較典型的植物荷爾蒙。⑥氣孔關閉；⑦基因沉默。因此，通過檢測活性氧爆發和胼胝質沉積可以確定植物是否產生免疫反應。
技術實現思路
本專利技術提供了，旨在解決現有技術提供的檢測植物產生免疫反應的方法，過程復雜、準確率低、實用性差的問題。本專利技術的目的在于提供，保持現有原核表達產物表達純化及胼胝質和活性氧觀察方法不變，包括原核表達技術、蛋白純化技術、DAB染色方法、苯胺藍染色方法均與常規相同，該方法還包括以下步驟采用稻瘟病菌蛋白基因的原核表達產物，按照5. Omg/ml濃度處理水稻持有不同抗性基因的24個水稻單基因系品種及根組織和葉鞘；24小時后進行DAB染色和苯胺藍染色，熒光顯微鏡直接觀察胼胝質和活性氧的形成情況，通過胼胝質和活性氧的形成情況判斷植物是否產生免疫反應。進一步，當觀察到胼胝質和活性氧形成時，則說明植物產生了免疫反應；當未觀察到胼胝質和活性氧形成時，則說明植物未產生免疫反應。進一步，獲得一個能夠引起多個持有不同抗性基因的水稻單基因系品種和感病品種麗江新團黑谷產生免疫反應的稻瘟病菌蛋白。本專利技術提供的檢測植物產生免疫反應的方法，保持現有原核表達產物表達純化及胼胝質和活性氧觀察方法不變，采用稻瘟病菌蛋白基因的原核表達產物，按照5. Omg/ml濃度處理水稻持有不同抗性基因的24個水稻單基因系品種及根組織和葉鞘；24小時后進行DAB染色和苯胺藍染色，熒光顯微鏡直接觀察胼胝質和活性氧的形成情況，通過胼胝質和活性氧的形成情況判斷植物是否產生免疫反應，該方法利用純化的效應蛋白基因的原核表達產物處理水稻根組織，通過熒光顯微鏡觀察根組織胼胝質和活性氧產生，能直接獲得水稻產生免疫反應情況，簡便、準確、快速，同時獲得一個能夠引起多個持有不同抗性基因的水稻單基因系品種和感病品種麗江新團黑谷產生免疫反應的稻瘟病菌蛋白，具有較強的推廣與應用價值。附圖說明圖1是本專利技術實施例提供的檢測植物產生免疫反應的方法的實現流程圖。具體實施例方式為了使本專利技術的目的、技術方案及優點更加清楚明白，以下結合附圖及實施例，對本專利技術進行進一步的詳細說明。應當理解，此處所描述的具體實施例僅僅用以解釋本專利技術，并不用于限定專利技術。圖1示出了本專利技術實施例提供的檢測植物產生免疫反應的方法的實現流程。本專利技術的目的在于提供，保持現有原核表達產物表達純化及胼胝質和活性氧觀察方法不變，包括原核表達技術、蛋白純化技術、DAB染色方法、苯胺藍染色方法均與常規相同，該方法還包括以下步驟在步驟SlOl中，采用稻瘟病菌蛋白基因的原核表達產物，按照5. Omg/ml濃度處理水稻持有不同抗性基因的24個水稻單基因系品種及根組織和葉鞘；在步驟S102中，24小時后進行DAB染色和苯胺藍染色，熒光顯微鏡直接觀察胼胝質和活性氧的形成情況，通過胼胝質和活性氧的形成情況判斷植物是否產生免疫反應。在本專利技術實施例中，當觀察到胼胝質和活性氧形成時，則說明植物產生了免疫反應；當未觀察到胼胝質和活性氧形成時，則說明植物未產生免疫反應。在本專利技術實施例中，獲得一個能夠引起多個持有不同抗性基因的水稻單基因系品種和感病品種麗江新團黑谷產生免疫反應的稻瘟病菌蛋白。下面結合附圖及具體實施例對本專利技術的應用原理作進一步描述。實施例一5. Omg/ml的融合蛋白處理水稻根組織和葉鞘24h，苯胺藍染色后直接觀察胼胝質以及DAB染色觀察活性氧產生。將稻瘟病菌效應蛋白基因表達產物于4°C離心機離心收集菌體，用新鮮配制的緩沖液(20mM Tris-HCl, ρΗ7· 4 ；200mM NaCl ；ImM EDTA ；10mM β-巰基乙醇)懸浮菌體。在冰水浴上進行超生破碎細胞后離心收集上清。處理是將該基因的原核表達產物純化后按照5. Omg/ml的濃度處理24個持有不同抗性基因的水稻單基因系的根組織和葉鞘24h，苯胺藍直接染色和DAB染色后觀察胼胝質和活性氧產生。結果見表發現，24個水稻品種均有不同程度的胼胝質沉積和活性氧產生。實施例二 5. Omg/ml的融合蛋白處理水稻根組織和葉鞘24h，苯胺藍染色后直接觀察胼胝質以及DAB染色觀察活性氧產生。將稻瘟病菌效應蛋白基因表達產物于4°C離心機離心收集菌體，用新鮮配制的緩沖液(20mM Tris-HCl, ρΗ7· 4 ；200mM NaCl ；lmM EDTA ；10mM β-巰基乙醇)懸浮菌體。在冰水浴上進行超生破碎細胞后離心收集上清。處理是將該基因的原核表達產物純化后按照5. Omg/ml的濃度處理感病水稻品種的根組織和葉鞘24h，苯胺藍直接染色和DAB染色后觀察胼胝質和活性氧產生。結果見表發現，感病水稻品種麗江新團黑谷均有不同程度的胼胝質沉積和活性氧產生。本專利技術的目的是克服現有技術之不足，而提供一種快速、簡便、準確的用稻瘟病菌蛋白基因的原核表達產物處理水稻葉片和根組織觀察胼胝質和活性氧產生以確定植物產生免疫反應，繼而進一步確定能夠廣泛引起水稻免疫反應產生的稻瘟病菌蛋白。本專利技術的技術方案是保持現有原核表達產物表達純化及胼胝質和活性氧觀察方法不變，包括原核表達技術、蛋白純化技術、DAB染色方法、苯胺藍染色方法均與常規相同，其特征是用稻瘟病菌蛋白基因的原核表達產物，按照5. Omg/ml濃度處理水稻持有不同抗性基因的24個水稻單基因系品種及麗江新團黑谷根組織和葉鞘24h后進行DAB染色和苯胺藍染色，熒光顯微鏡直接觀察胼胝質和活性氧形成。本專利技術的有益效果在于1、方法簡便、準確、快速。2、利用純化的效應蛋白基因的原核表達產物處理水稻根組織，通過熒光顯微鏡觀察根組織胼胝質和活性氧產生，能直接獲得水稻產生免疫反應情況。 3、獲得一個能夠引起多個持有不同抗性基因的水稻單基因系品種和感病品種麗江新團黑谷產生免疫反應的稻瘟病菌蛋白。本專利技術實施例提供的檢測植物產生免疫反應的方法，保持現有原核表達產物表達純化及胼胝質和活性氧觀察方法不變，采用稻瘟病菌蛋白基因的原核表達產物，按照5. Omg/ml濃度處理水稻持有不同抗性基因的24個水稻單基因系品種及根組織和葉鞘；24小時后進行DAB染色和苯胺藍染色，熒光顯微鏡直接觀察胼胝質和活性氧的形本文檔來自技高網...
【技術保護點】
一種檢測植物產生免疫反應的方法，保持現有原核表達產物表達純化及胼胝質和活性氧觀察方法不變，包括原核表達技術、蛋白純化技術、DAB染色方法、苯胺藍染色方法均與常規相同，其特征在于，該方法還包括以下步驟：采用稻瘟病菌蛋白基因的原核表達產物，按照5.0mg/ml濃度處理水稻持有不同抗性基因的24個水稻單基因系品種及根組織和葉鞘；24小時后進行DAB染色和苯胺藍染色，熒光顯微鏡直接觀察胼胝質和活性氧的形成情況，通過胼胝質和活性氧的形成情況判斷植物是否產生免疫反應。
【技術特征摘要】
1.一種檢測植物產生免疫反應的方法，保持現有原核表達產物表達純化及胼胝質和活性氧觀察方法不變，包括原核表達技術、蛋白純化技術、DAB染色方法、苯胺藍染色方法均與常規相同，其特征在于，該方法還包括以下步驟 采用稻瘟病菌蛋白基因的原核表達產物，按照5. Omg/ml濃度處理水稻持有不同抗性基因的24個水稻單基因系品種及根組織和葉鞘； 24小時后進行DAB染色和苯胺藍染色，熒光顯微鏡直...
【專利技術屬性】
技術研發人員：楊靜，李成云，劉林，朱有勇，徐暢，施竹鳳，
申請(專利權)人：云南農業大學，
類型：發明
國別省市：
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