本發明專利技術涉及一種具有植物免疫激活作用的軟腐歐文氏菌、從其中提取的免疫激活蛋白及其應用。該軟腐歐文氏菌于2012年8月15日保藏于中國普通微生物菌種保藏管理中心，保藏編號為CGMCCNo.6433。本發明專利技術得到的軟腐歐文氏菌能夠誘導植物本身產生抗性反應，對植物起到免疫激活作用。經驗證，該軟腐歐文氏菌中起免疫激活作用的物質是其產生的一種蛋白，將其命名為EccPR蛋白，該蛋白用于植物免疫激活，能使植物體內抗性基因表達明顯提高，從而有效地誘導植物對病原菌起到抗性作用。
【技術實現步驟摘要】
本專利技術涉及一種具有植物免疫激活作用的軟腐歐文氏菌、從其中提取的免疫激活蛋白及其應用。
技術介紹
我國是當今世界首屈一指的農業大國，但由于多方面的原因，重大病害出現的頻率和面積明顯增加，造成的產量損失都在10%左右。河北省主要農作物、經濟作物如小麥、玉米、棉花等和大棚蔬菜每年因病蟲害的損失也是巨大的，據估計可達數十億元。為了對付嚴重的農作物病害，農業生產者大量使用化學農藥。化學農藥的施用也確實對農作物病害的控制做出了巨大的貢獻。但是，化學農藥的大量施用也正在顯示著嚴重的負面影響。因此，在全球范圍內研究、開發和生產安全、無毒副作用、對環境友好的生物制劑成為新產業的發展重點。隨著生物防治、綠色農業等呼聲日益高漲，植物抗病免疫技術的研究成為近年興起的重要研究領域。植物免疫抗病激活劑是一些生物和非生物因子，能夠誘導植物獨特的生理狀態，植物能夠更好或更快或者既好又快的調配防衛反應的生理狀態，使植物防御病蟲害的狀態處在臨界，達到一觸即發，當病害在侵染植物時，植物會在短時間內借助于誘導因子激發植物整體的抗性水平，調動整個植物的免疫能力，激活植物自身抗病相關基因的表達，抵抗病原物的侵染，自身不對病原菌起作用，不會使病原菌產生抗藥性，用量低、高效、誘導的植物抗病譜廣、抗病持續時間長，這對于植物病害的可持續控制具有重要的意義。軟腐歐文氏菌是一種廣泛的致病菌，主要發生在大白菜、卷心菜、菜花、馬鈴薯等作物上，主要為害葉、莖及塊莖。葉染病近地面老葉先發病，病部呈不規則暗褐色病斑，濕度大時腐爛。莖部染病多始于傷口，再向莖干蔓延，后莖內髓組織腐爛，具惡臭，病莖上部枝葉萎蔫下垂，葉變黃。塊莖染 病多由皮層傷口引起，初呈水浸狀，后薯塊組織崩解，發出惡臭。
技術實現思路
本專利技術的目的提供一種具有植物免疫激活作用的軟腐歐文氏菌、從其中提取的免疫激活蛋白及其應用。本專利技術采取的技術方案 一種具有植物免疫激活作用的胡蘿卜軟腐歐文氏菌胡蘿卜軟腐亞種份carotovora subsp. Carotovora strain Ecc 601,于 2012 年 8 月 15 日保藏于中國普通微生物菌種保藏管理中心，保藏編號為CGMCC No. 6433。所述的軟腐歐文氏菌Erwinia carotovora subsp. Carotovora strain Ecc 601中提取的免疫激活蛋白，其提取方法如下(I)將 min1-Tn5_Km 轉座子插入軟腐歐文氏菌 Erwinia carotovora subsp.Carotovora strain Ecc 601中，篩選出不能使煙草葉片出現過敏反應即葉片上出現壞死斑的突變菌； (2)利用轉座子min1-Tn5-Km上的Km標簽，通過RACE-PCR擴增上述突變菌中轉座子插入點兩端的DNA片段，經過測序拼接后，獲得DNA序列； (3)將步驟(2)得到的DNA序列連接到pET30a(+)上，并將其轉入到大腸桿菌E.coliBL21 中，獲得工程菌 E. coli BL21 (pET30a_EccPR); (4)將工程菌Ε·coli BL21 (pET30a-EccPR)誘導培養獲得具有植物免疫激活作用的免疫激活蛋白。所述的免疫激活蛋白的應用。本專利技術的有益效果本專利技術得到的軟腐歐文氏菌能夠誘導植物本身產生抗性反應，對植物起到免疫激活作用。經驗證，該軟腐歐文氏菌中起免疫激活作用的物質是其產生的一種蛋白，將其命名為EccPR蛋白，該蛋白用于植物免疫激活，能使植物體內抗性基因表達明顯提高，從而有效地誘導植物對病原菌起到抗性作用。具體實施例方式本專利技術篩選得到一種具有植物免疫激活作用的軟腐歐文氏菌^nrifliacarotovora subsp. Carotovora strain Ecc 601,該菌株作為病原菌侵染擬南芥時,不能使擬南芥染病，而且將這種菌接種于煙草葉片，煙草葉片能夠過敏反應，出現壞死斑。本專利技術從軟腐歐文氏菌iZnfiflia car ο tovora subsp. Caro tovora strain Ecc601中提取EccPR蛋白的過程如下 (1)將min1-Tn5_Km 轉座子插入軟腐歐文氏菌 Erwinia carotovora subsp.Carotovora strain Ecc 601 中獲得突變菌種庫,篩選出不能使煙草葉片出現過敏反應的突變菌carotovora subsp. Carotovora strain Ecc 仰27淑，即在該菌株中轉座子的插入破壞了軟腐歐文氏菌份carotovora subsp. Carotovora strain Ecc 601中能使植物對病原菌產生抗性的功能單元的結構； (2)利用轉座子min1-Tn5-Km上的Km標簽，通過RACE-PCR擴增轉座子插入點兩端的DNA片段，經過測序拼接后，獲得DNA序列； (3)將步驟(2)得到的DNA序列連接到pET30a(+)上，并將其轉入到大腸桿菌E.coliBL21 中，獲得工程菌 E. coli BL21 (pET30a_EccPR); (4)將工程菌Ε·coli BL21 (pET30a-EccPR)誘導培養獲得具有植物免疫激活作用的免疫激活蛋白EccPR，其具體過程為 將工程菌E. coli BL21 (pET30a-EccPR)單菌落挑起于LB培養基中在37°C下進行過夜培養，將其作為母種，第二天將母種以1%接種量接種于液體LB培養基中，在37°C下進行培養5-7小時，在其培養液中加入0. 4mM的IPTG進行誘導培養，誘導6_8小時后，將該培養液進行離心，獲得的菌體然后將其水懸浮并煮沸10-15分鐘，離心后將上清冷凍干燥，獲得含有70-80%發酵免疫激活蛋白EccPR的粗蛋白，如果要獲得純免疫激活蛋白EccPR，則將其過層析柱即可得到純品免疫激活蛋白EccPR。本專利技術得到的EccPR蛋白在誘導植物產生抗病性中應用 將濃度為lmg/ml的EccPR免疫激活蛋白溶液分別噴施到擬南芥、黃瓜和煙草上，每7天噴施一次，每次噴施蛋白總量為20-25mg/株，總共噴施3次。最后一次噴施20天后，分別在擬南芥上接種丁香假單胞桿菌DC3000，在黃瓜上接種枯萎病菌，在煙草上接種軟腐歐文氏菌 Erwinia carotovora subsp. Carotovora strain Ecc。同時用不噴施 EccPR 免疫激活蛋白溶液的植物個體做對照。培養72小時后，發現在沒有噴施激活蛋白EccPR的植物上都染病，而噴施的植物上染病率是20%，而且這些染病的植物都產生了過敏反應。用激活蛋白EccPR處理過的植物葉片中的病原菌數目比未處理的降低了 45%，而且相應的抗性基因表達都有明顯的提高PR1提高7. 3倍，PR5提高1. 8倍，PDF1. 2提高11. 7倍，Thi2.1提高21.1倍，VSP2.1提高43. 4倍。這些說明EccPR免疫激活蛋白是一種有效的誘抗劑，能夠有效的誘導植物對病原菌起到抗性作用，而且這種使用方法能夠最佳誘導植物產生抗性。EccPR蛋白還具有促進種子萌發和促進植物生長的作用 將免疫激活蛋白EccPR純品溶解在水中，分別配制不同濃度的溶液，溶液濃度分別為O. O lm本文檔來自技高網...
【技術保護點】
一種具有植物免疫激活作用的軟腐歐文氏菌Erwinia?carotovora?subsp.?Carotovora?strain?Ecc?601，其特征在于其于2012年8月15日保藏于中國普通微生物菌種保藏管理中心，保藏編號為CGMCC?No.?6433。
【技術特征摘要】
1.一種具有植物免疫激活作用的軟腐歐文氏菌Erwinia carotovora subsp.Carotovora strain Ecc 601,其特征在于其于2012年8月15日保藏于中國普通微生物菌種保藏管理中心，保藏編號為CGMCC No. 6433。2.由權利要求1所述的軟腐歐文氏菌Erwiniacarotovora subsp. Carotovorastrain Ecc 601中提取的免疫激活蛋白，其特征在于其提取方法如下 (1)將min1-Tn5_Km 轉座子插入軟腐歐文氏菌 Erwinia carotovora subsp.Carotovora stra...
【專利技術屬性】
技術研發人員：賈振華，宋水山，劉方，馬宏，趙芊，黃亞麗，
申請(專利權)人：河北省科學院生物研究所，
類型：發明
國別省市：
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