解淀粉芽孢桿菌及其用途制造技術(shù)

本發(fā)明專利技術(shù)涉及一種有抑菌效果和提高動(dòng)物免疫能力的解淀粉芽孢桿菌的篩選及應(yīng)用。本發(fā)明專利技術(shù)公開了一種解淀粉芽孢桿菌，其保藏名稱：解淀粉芽孢桿菌?SC06?(Bacillus?amyloliquefaciens?SC06)，保藏單位：中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏地址：中國?武漢?武漢大學(xué)；保藏日期：2012年7月11日，保藏號(hào)：CCTCC?No:?M2012280。解淀粉芽孢桿菌?SC06接種于LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)后，離心取菌泥，干燥至恒重，與玉米淀粉等混合后制成干菌粉；在動(dòng)物的常規(guī)飼料中添加上述干菌粉，喂食動(dòng)物；從而實(shí)現(xiàn)用于抑菌或者用于提高動(dòng)物的免疫能力，動(dòng)物是指水生動(dòng)物或畜禽。

【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】

本專利技術(shù)涉及一種有抑菌效果和提高動(dòng)物免疫能力的解淀粉芽孢桿菌的篩選及應(yīng)用。
技術(shù)介紹
我國作為世界水產(chǎn)大國，也是世界上唯一水產(chǎn)養(yǎng)殖產(chǎn)量高于捕撈產(chǎn)量的國家，2002年水產(chǎn)養(yǎng)殖產(chǎn)量高達(dá)2770萬噸，約占世界水產(chǎn)養(yǎng)殖總產(chǎn)量的70%，這主要得益于我國水產(chǎn)養(yǎng)殖集約化程度的不斷提高。水產(chǎn)養(yǎng)殖已成為我國漁業(yè)發(fā)展的重點(diǎn)，是我國大農(nóng)業(yè)中發(fā)展較快、活力較強(qiáng)、經(jīng)濟(jì)效益較高的產(chǎn)業(yè)之一。伴隨著我國水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的迅猛發(fā)展，各類水產(chǎn)病害亦迅猛增長(zhǎng)，據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)，目前水產(chǎn)養(yǎng)殖病害在300種以上，每年約有1/10的養(yǎng)殖面積發(fā)生病害，年損失產(chǎn)量占養(yǎng)殖總產(chǎn)量的15 % 30 %，經(jīng)濟(jì)損失高達(dá)數(shù)百億元，水產(chǎn)動(dòng)物病害已成為影響我國水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展的主要制約因素(黃艷平等，2004)。 針對(duì)水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)病害爆發(fā)頻率的加劇，抗生素作為重要的抗細(xì)菌性疾病的藥物，在水產(chǎn)養(yǎng)殖上得到廣泛應(yīng)用。如用青霉素和硫酸鏈霉素治療親魚產(chǎn)后受傷引起感染及羅非魚的潰爛病、赤皮病、打印病；用慶大霉素治療草魚“三病”(腸炎病、爛鰓病、赤皮病)；用紅霉素治療球菌引起的感染和虹鱒魚的細(xì)菌性腎臟疾病等都收到良好的效果；加氯霉素可以抑制淡水養(yǎng)殖中的致病性氣單胞菌，氟喹諾酮類抗菌素可以抑制海水養(yǎng)殖中致病性弧菌。這在一定程度上極大地促進(jìn)了水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展。但同時(shí)，養(yǎng)殖水體中長(zhǎng)期使用抗生素已引發(fā)一系列環(huán)境和社會(huì)問題，尤其是過量的使用抗生素使水體微生物選擇壓力增大，一方面導(dǎo)致抗藥微生物滋生，可改變水體微生物群落結(jié)構(gòu)，惡化水體的適養(yǎng)性，另一方面引起水產(chǎn)動(dòng)物體內(nèi)菌群失調(diào)，易引發(fā)內(nèi)源性、外源性和二重感染(胡彩紅，2005)。因此，限制和減少抗生素類藥物在水產(chǎn)養(yǎng)殖水體中的使用，尋找抗生素的替代品已經(jīng)成為水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展的必然趨勢(shì)。益生菌不僅可避免抗生素的副作用、達(dá)到防治疾病的效果，而且能促進(jìn)動(dòng)物生長(zhǎng)。近年來，益生菌作用抗生素類藥物的替代物，在養(yǎng)殖業(yè)得到廣泛的關(guān)注。現(xiàn)代微生態(tài)學(xué)研究表明，微生物在水產(chǎn)養(yǎng)殖中占有重要的地位，直接影響產(chǎn)量、物質(zhì)循環(huán)、動(dòng)物營養(yǎng)、水質(zhì)、疾病控制及養(yǎng)殖水環(huán)境(Moriarty, 1998)。隨著微生物學(xué)和微生態(tài)學(xué)的深入研究,利用益生菌來調(diào)節(jié)動(dòng)物體內(nèi)生態(tài)環(huán)境、改善養(yǎng)殖生態(tài)環(huán)境、增強(qiáng)機(jī)體免疫功能、抑制病原微生物、減少疾病發(fā)生，正逐漸成為各國研究熱點(diǎn)。由于益生菌制品沒有殘留，也不會(huì)產(chǎn)生抗藥性，在中國、印度等水產(chǎn)養(yǎng)殖大國得到廣泛的應(yīng)用，并主張用其替代抗生素。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
本專利技術(shù)要解決的技術(shù)問題是提供一種解淀粉芽孢桿菌，該解淀粉芽孢桿菌有抑菌效果和提高動(dòng)物免疫能力。為了解決上述技術(shù)問題，本專利技術(shù)提供一種解淀粉芽孢桿菌，保藏名稱解淀粉芽孢桿菌SC06 (Bacillus amyloliquefaciens SC06),保藏單位中國典型培養(yǎng)物保藏中心,保藏地址中國武漢武漢大學(xué)；保藏日期2012年7月11日，保藏號(hào)CCTCC No: M2012280。本專利技術(shù)還同時(shí)提供了上述解淀粉芽孢桿菌的用途，用于抑菌或者用于提高動(dòng)物的免疫能力。作為本專利技術(shù)的解淀粉芽孢桿菌的用途的改進(jìn)動(dòng)物為水生動(dòng)物或畜禽。本專利技術(shù)以SC06菌株總DNA為模板，使用通用引物上游引物(Pl):5’ 一 AGAGTTTGATCCTGGTCAGAACGAACGCT —3，下游引物(P6):5’ 一 TACGGCTACCTTGTTACGACTTCACCCC — 3’ ；進(jìn)行PCR擴(kuò)增獲得的16s rDNA部分序列；通過Blast與GenBank收錄的細(xì)菌16srDNA基因序列比對(duì)，發(fā)現(xiàn)SC06菌株與解淀粉芽孢桿菌的同源性為99%。本專利技術(shù)的解淀粉芽孢桿菌可作為益生菌用于提高水生動(dòng)物、畜禽生長(zhǎng)，并提高其抗氧化和免疫功能。本專利技術(shù)的解淀粉芽孢桿菌實(shí)際使用時(shí)，可采取向水中投放解淀粉芽孢桿菌SC06的方法，一般控制解淀粉芽孢桿菌SC06在水體中的濃度為O. 5飛X 107CFU/mL ;也可在每克常規(guī)水生動(dòng)物/畜禽基礎(chǔ)日糧中添加解淀粉芽孢桿菌SC06 O. 5飛X 105CFU。本專利技術(shù)的解淀粉芽孢桿菌也可先制成干菌粉，再進(jìn)行如上操作。附圖說明 下面結(jié)合附圖對(duì)本專利技術(shù)的具體實(shí)施方式作進(jìn)一步詳細(xì)說明。圖1是SC06的掃描電鏡圖片；圖2是SC06對(duì)甲魚生長(zhǎng)的影響對(duì)比圖。具體實(shí)施例方式實(shí)施例1、解淀粉芽孢桿菌SC06的獲得I)、制備稀釋液稱取土壤(采自杭州郊區(qū)蔬菜地)2g，放入IOOml無菌水中，用高速組織搗碎機(jī)搗碎。無菌操作吸取搗碎液1. Oml加入9. Oml無菌水中，再用無菌水稀釋為10_\10_2，10 _3、ΙΟ'ΙΟ'ΙΟ '10_7共七個(gè)濃度梯度。2)、培養(yǎng)取各濃度的稀釋液IOOul分別涂布于LB培養(yǎng)基平板(蛋白胨10g/L，NaCl 10g/L,酵母浸出物5g/L，瓊脂16g/L，其余為水；用IOmoI/L NaOH調(diào)節(jié)pH7. 0，121°C滅菌20分鐘)，晾干后倒置恒溫箱內(nèi)30°C培養(yǎng)。3)、菌株的分離、純化在LB培養(yǎng)基上于30°C培養(yǎng)48 h，即有菌落出現(xiàn)。用接種針挑取單個(gè)菌落，在LB培養(yǎng)基平板表面連續(xù)劃線培養(yǎng)，選擇那些形態(tài)不一樣的菌落，重復(fù)幾次后便可形成單獨(dú)孤立的菌落，因而獲得純培養(yǎng)菌株。4)、不同時(shí)間抑菌效果測(cè)定將每個(gè)單菌落活化后分別置于50ml胰蛋白胨大豆肉湯培養(yǎng)基(Tryptone soyaBroth, TSB，購自杭州微生物試劑廠公司)中培養(yǎng)，初始接種濃度為1. OX IO6 CFU/mL, 24h后調(diào)整各菌液至1. OX IO9 CFU/mL備用。LB培養(yǎng)基平板高溫滅菌(121°C滅菌20分鐘)后，冷卻至50-60°C后，按照1% (體積比)的接種量加入一種病原性細(xì)菌菌液(培養(yǎng)16h的嗜水氣單胞菌(Aeromonas HydroPhila ATCC 14715)、副溶血弧菌(Vibrio ParahaemolyticusATCC 27519)和突光假單胞菌(Pseudomonas fluorescens ATCC 13525)),倒平板,放置無菌室約lh，倒置放于4°C冰箱中l(wèi)h，用直徑O. 25cm打孔器在平板表面均勻的打孔，然后按照每孔10 μ I的加樣量加入被篩選菌株菌液，在30°C培養(yǎng)，每隔3h取樣，測(cè)定24h內(nèi)的抑菌圈直徑變化，每個(gè)平皿設(shè)3個(gè)重復(fù)。挑選出對(duì)所試3株病原性細(xì)菌的總抑制效果最佳的菌落，命名為SC06。SC06對(duì)嗜水氣單胞菌和副溶血弧菌抑制效果最為明顯，12h抑菌環(huán)平均直徑分別為16. 2和13. 1mm，對(duì)熒光假單胞菌12h抑菌環(huán)平均直徑為9. 4mm。5)、SC06拮抗性測(cè)定將菌株SC06在LB液體培養(yǎng)基(蛋白胨10g/L，NaCl 10g/L，酵母浸出物5g/L，其余為水；用10mol/L NaOH調(diào)節(jié)pH7.0，121°C滅菌20分鐘)30°C進(jìn)行培養(yǎng)，每隔3h取樣，測(cè)定其0D600。結(jié)果顯示，SC06生長(zhǎng)較快，18h的OD600為1. 72±0· 16。6)、共凝集試驗(yàn)參照Chabrillon M.，et al 2005方法并稍作修改進(jìn)行。于LB液體培養(yǎng)基中接種病原性細(xì)菌和被篩選細(xì)菌，30°C過夜培養(yǎng)，測(cè)定其0D600，并將其OD稀釋至O. 5，然后取菌株SC06和病原性細(xì)菌各1. 5ml于無菌具塞試管中，渦旋振蕩混勻，30°C靜置培養(yǎng)4h后測(cè)定0D_。3.0ml的病原性細(xì) 菌或被篩選細(xì)菌30°本文檔來自技高網(wǎng)...

【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
解淀粉芽孢桿菌，其特征是：保藏名稱：解淀粉芽孢桿菌?SC06?(Bacillus?amyloliquefaciens?SC06)，保藏單位：中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏地址：中國?武漢?武漢大學(xué)；保藏日期：2012年7月11日，保藏號(hào)：CCTCC?No:?M?2012280。

【技術(shù)特征摘要】
1.解淀粉芽孢桿菌，其特征是保藏名稱解淀粉芽孢桿菌SC06 (Bacillus amyloliquefaciens SC06),保藏單位 中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏地址中國武漢武漢大學(xué)；保藏日期2012年7月11日...

【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：李衛(wèi)芬，鄧斌，張小平，黃琴，姚江濤，余東游，
申請(qǐng)(專利權(quán))人：浙江大學(xué)，
類型：發(fā)明
國別省市：