本發(fā)明專利技術(shù)屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種對鱗翅目有毒的人工合成的蘇云金芽孢桿菌殺蟲基因，該人工合成的基因包含Vip83Cry9Ca*基因的核苷酸序列及其編碼的氨基酸序列。包含該基因質(zhì)粒的大腸桿菌(Escherichia?coli)DH5α/Bt./6p/pGEVC9C保藏在中國典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)，保藏編號為CCTCC?NO：M2011363。經(jīng)過生物學(xué)實驗驗證，證明該殺蟲融合基因?qū)[翅目具有毒性，可專一性毒殺小菜蛾等農(nóng)業(yè)害蟲。本發(fā)明專利技術(shù)公開了上述融合蛋白在轉(zhuǎn)基因殺蟲微生物方面的應(yīng)用。
【技術(shù)實現(xiàn)步驟摘要】
本專利技術(shù)涉及微生物基因工程領(lǐng)域，具體涉及一種人工合成的對鱗翅目有高毒力的Bt雙價融合蛋白及其編碼基因，該基因包括Vip83*和Cry9Ca*基因及其所述的構(gòu)成和編碼序列。
技術(shù)介紹
蘇云金芽孢桿菌(Bacillus thuringiensis)是口前最常用的商品化殺蟲微生物，其表達殺蟲晶體蛋白(Insecticidal crystal proteins),營養(yǎng)期殺蟲蛋白(Vegetativeinsecticidal proteins),對鱗翅目等農(nóng)業(yè)上常見害蟲具有專一'丨生毒殺作用(喻子牛etal.，1996) ο目前，在生產(chǎn)應(yīng)用中使用最多的是殺蟲晶體蛋白(ICPs)，ICPs主要分為倆大類，Cry類蛋白和Cyt類蛋白，截止2009年6月6日，克隆得到的ICPs基因已增至58群449中Cry類基因，2群27種Cyt基因(Crickmoreet al., 1998)。其晶體結(jié)構(gòu)與功能以及殺蟲機制已有了一定的了解(Li et al.,1991)。Cry類蛋白又稱為δ內(nèi)毒素，在序列結(jié)構(gòu)上分為明顯的N-半段跟C-半段，其中C-半段富含二硫鍵，而N-半段為核心毒性區(qū)，在空間結(jié)構(gòu)上有分為3個結(jié)構(gòu)域(Schn印f etal.，1998)。Domain I 6個親水的α螺旋圍繞一個疏水的α 5螺旋，Domain II三個反平行β 折疊片.Domain III 兩個反平行 β 折疊片形成 β-sandwich (Galitsky et al..2001)。Cry類蛋白在進入敏感昆蟲的中腸之后，在堿性環(huán)境下水解，切掉C-半段和N-段的幾個氨基酸殘基，活化成具有活性的δ內(nèi)毒素，然后Domain II上各突起與敏感昆蟲中腸上皮細胞的受體鈣粘蛋白(Cadherin-like Protein)結(jié)合，形成毒素寡聚體，然后再與第二受體糖基磷酰肌糖錨定氨基多肽酶(GP1-APN)或者糖基磷酰肌糖錨定堿性磷酸酶(GP1-ALP)結(jié)合(Bravo et al. , 2004),誘使毒素構(gòu)象發(fā)生變化,Domain I中疏水的α 5螺旋伸出插入到昆蟲中場上皮細胞的細胞膜，形成膜離子通道，進而引起細胞滲透平衡被破壞，細胞吸脹破裂，最后導(dǎo)致腸壁破裂，昆蟲死亡(Bravo et al., 2004)。一般認為Domain III起到防止毒素被蛋白酶降解的作用，并參與到一部分受體的識別過程(Li et al.，1991)。自1996年轉(zhuǎn)基因作物實現(xiàn)商業(yè)化以來，全球轉(zhuǎn)基因作物種植面積每年均以兩位數(shù)的百分率迅速增長。繼2006年突破了 I億公頃后，2007年全球轉(zhuǎn)基因作物種植面積已達1.143億公頃，較1996年增長了 67倍(張銳et al.，2007)。轉(zhuǎn)基因作物育種已成為最富活力的農(nóng)業(yè)技術(shù)，不僅創(chuàng)造了可觀的經(jīng)濟、社會和生態(tài)效益，而且顯示出對于未來解決環(huán)境、能源等重大問題的巨大潛力。目前，應(yīng)用在發(fā)酵生物農(nóng)藥和轉(zhuǎn)基因植物的主要為Cry類蛋白，但由于現(xiàn)在使用的Bt.殺蟲基因存在著種類單一，害蟲抗性增加迅速的問題。大多數(shù)為Bt.δ-內(nèi)毒素晶體毒蛋白的CrylAc，少部分為嵌合的CrylAb ;另外許多準備釋放的轉(zhuǎn)抗蟲基因玉米和水稻大多數(shù)也是這兩種基因。這種單一的抗蟲基因推廣給各種抗蟲作物種植的抗蟲性保持存在較大的風險，會縮短害蟲對這兩種基因產(chǎn)生抗性的時間。經(jīng)實驗證實，CrylAc在棉鈴蟲中腸上皮細胞結(jié)合區(qū)位于鈣粘蛋白Cadherin第1217-1461位于245個氨基酸殘基組成的肽鏈上。這個區(qū)域的缺失或者突變可能導(dǎo)致棉鈴蟲抗性的急劇增加(Peng et al.,2010) 因此，開發(fā)新型殺蟲蛋自，或者將不存在交叉抗性的幾種殺蟲蛋白構(gòu)建成融合基因，可以減緩害蟲抗性產(chǎn)生的速率，這已經(jīng)成為當前轉(zhuǎn)基因研究的熱點。營養(yǎng)期殺蟲蛋白Vip3A被譽為第二代殺蟲蛋白，與殺蟲晶體蛋白ICPs不同，Vip3A蘇云金芽孢桿菌營養(yǎng)生長期所產(chǎn)生的蛋白，對鱗翅目昆蟲具有很獨特的殺蟲活性，尤其對ICPs有抗性的小地老虎的毒性比CrylAc高260倍，對鞘翅目無效。它不同于Bt芽孢期產(chǎn)生的晶體毒蛋白ICPs，其晶體結(jié)構(gòu)，敏感昆蟲腸道受體，殺蟲作用機理尚不明確(Estruchet al.，1996)。Vip3A在昆蟲腸道內(nèi)被水解為四種主要蛋白產(chǎn)物，其中33KD的蛋白水解產(chǎn)物為Vip3A蛋白的毒性核心結(jié)構(gòu)。Vip3A毒蛋白只要在pH5.0-10.0時均可溶解，其C-末端也不被切除，與敏感昆蟲上皮細胞結(jié)合，誘發(fā)昆蟲細胞凋亡，細胞核溶解，最終昆蟲死亡。這個可能的毒性機制不能排除 孔形成機制(Yu et al.，1997)。與晶體毒素相比較，營養(yǎng)期殺蟲蛋白的研究還剛剛起步不久。Estruch已經(jīng)成功地將Vip3Aa基因與不同的啟動子(如PEPC，Ubi和MTL等)構(gòu)成表達質(zhì)粒通過粒子轟擊法導(dǎo)入玉米愈傷組織，得到的轉(zhuǎn)基因玉米，對小地老虎和草地貪夜蛾的殺蟲效果都很好。peng等評價了轉(zhuǎn)BtVip3A基因的安全性，急性和亞急性的毒理學(xué)研究未發(fā)現(xiàn)負面的作用，證明利用Vip3A進行生物害蟲防治是安全的(Peng et al.，2007)。相信在未來的時間里，營養(yǎng)期殺蟲蛋白在延緩害蟲對Bt毒素抗性進化上將發(fā)揮重要作用。Vip83基因是本申請人所在的農(nóng)業(yè)微生物國家重點實驗室從蘇云金芽孢桿菌YBT-833中克隆得到的，這個基因與Vip3A存在兩個氨基酸的差異(即Gln284 — Lys284，Pro804 — Ser8tl4)，屬于Vip3A家族，對小菜蛾，棉鈴蟲，甜菜夜蛾等鱗翅目具有毒力(蔡啟良et al.，2002)。Vip3A與ICP兩種毒蛋白在昆蟲中腸作用機制不同，二者對昆蟲不產(chǎn)生交叉抗性，因此將兩種殺蟲蛋白同時喂食害蟲可以減緩其產(chǎn)生抗性的速率，目前將Vip3A和Cry9Ca作融合表達未見先例。
技術(shù)實現(xiàn)思路
本專利技術(shù)的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，針對目前轉(zhuǎn)基因Bt.殺蟲蛋白資源存在的不足，本專利技術(shù)合成了一種能夠提高殺蟲毒力和減緩害蟲抗性的抗蟲融合基因，該基因根據(jù)陸地棉偏愛性密碼子優(yōu)化后的基因序列(其核苷酸序列和編碼的氨基酸序列見序列表SEQ ID NO:1所示，其蛋白質(zhì)的序列見SEQ ID NO:2所示)，本專利技術(shù)涉及該基因編碼的融合蛋白以及該融合蛋白的用途。本專利技術(shù)以申請人所在的農(nóng)業(yè)微生物國家重點實驗室保存的Vip83基因(參見:Genebank登錄號AY044227)和Cry9Ca基因的氨基酸序列(參見:Genebank登錄號AX100534)為藍本，根據(jù)陸地棉偏愛的密碼子，優(yōu)化后人工合成了二個Bt.殺蟲基因，申請人將該兩個基因分別命名為Vip83*和Cry9Ca*。其中，Cry9Ca*只包括有活性的N-半段δ內(nèi)毒素。申請人將上述得到的Vip83*和Cry9Ca*進行融合后得到如序列表SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列以及SEQ ID NO:2所示蛋白質(zhì)的序列。本專利技術(shù)通過以下技術(shù)方案來實現(xiàn)目的:申請人:提供了一段殺蟲融合基因，該基因包括從5’ _3’，依次含有編碼Vip83*毒素的核苷酸序列和編碼或切除了 C半段的Cry9Ca*的核苷酸序列；且上述兩個蛋白的核苷酸序列使用同一個開放閱讀框內(nèi)，中間用一段腸激酶序列(EK site)分開。該基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:1所示，序列全本文檔來自技高網(wǎng)...
【技術(shù)保護點】
一種人工合成的融合殺蟲基因，其核苷酸序列如序列表SEQ?ID?NO：1所述。
【技術(shù)特征摘要】
1.一種人工合成的融合殺蟲基因，其核苷酸序列如序列表SEQ ID N0:1所述。2.一種融合殺蟲蛋白，其蛋白質(zhì)的序列如序列表SEQ ID NO:2所述，其分子量為159.433.40kDa。3.—種表達蘇云金芽胞桿菌殺蟲融合蛋白的大腸桿菌(Escherichia coli)DH5 α /Bt./6p/pGEVC9C，保藏在中...
【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：劉子鐸，董方，林擁軍，史瑞平，
申請(專利權(quán))人：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)，
類型：發(fā)明
國別省市：
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