一種檢測(cè)核酸降解組的通用探針芯片方法技術(shù)

一種檢測(cè)核酸降解組的通用探針?lè)椒ǎㄈ缦虏襟E：1）采用生物信息學(xué)方法預(yù)測(cè)可能被小分子RNA降解的目標(biāo)核酸降解組mRNA；2）設(shè)計(jì)一端部的部分核酸序列與目標(biāo)核酸降解組mRNA斷裂處的部分核酸序列互補(bǔ)的檢測(cè)探針；3）將檢測(cè)探針固定在生物芯片基質(zhì)上形成生物芯片；4）提取待檢測(cè)樣本RNA，在其5’端接上一段接頭，并進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄；5）采用與接頭序列互補(bǔ)的正向引物以及與反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物部分互補(bǔ)的反向引物對(duì)反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物進(jìn)行PCR擴(kuò)增；6）將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物和通用報(bào)告探針混入雜交液中與生物芯片雜交；7）洗滌雜交后的生物芯片，檢測(cè)雜交結(jié)果。本發(fā)明專(zhuān)利技術(shù)能夠高通量的檢測(cè)小分子RNA介導(dǎo)的靶基因mRNA降解產(chǎn)物，且操作簡(jiǎn)便，價(jià)格低廉，具有高性?xún)r(jià)比，利于推廣。

【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】

本專(zhuān)利技術(shù)特別涉及一種用于核酸降解組檢測(cè)的通用探針檢測(cè)方法，屬于核酸分子檢測(cè)

技術(shù)介紹
內(nèi)源性非編碼小 RNA (small non-protein-coding RNA, 12_24nt)廣泛存在于高等和低等生物體內(nèi)，通過(guò)對(duì)靶基因mRNA直接切除或抑制其翻譯在轉(zhuǎn)錄及轉(zhuǎn)錄后水平對(duì)基因表達(dá)起調(diào)節(jié)作用。已知的小RNA主要分為兩大類(lèi):一類(lèi)是微小RNA (miRNA, microRNA),一類(lèi)是小干擾 RNA(siRNA, small interfering RNA)。參閱圖1,植物 miRNA、siRNA 以及部分動(dòng)物miRNA、siRNA主要通過(guò)與靶基因mRNA進(jìn)行完全或近乎完全的配對(duì)形成沉默復(fù)合體RISC (RNA-1nduced silencing complex),從而降解祀基因mRNA并調(diào)控其表達(dá),且大量實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明小分子RNA介導(dǎo)的靶基因斷裂發(fā)生在與mRNA的互補(bǔ)區(qū)，主要發(fā)生在對(duì)應(yīng)小分子RNA序列5’端的第十、十一位之間。并且。斷裂后靶基因mRNA的5’端含有磷酸基團(tuán)，有利于RNA連接酶的連接。常規(guī)的靶基因查找主要采用生物信息學(xué)方法在全基因組水平上進(jìn)行預(yù)測(cè)和篩選。由于預(yù)測(cè)方法無(wú)法區(qū)分預(yù)測(cè)靶基因的真?zhèn)危蓄A(yù)測(cè)結(jié)果必須經(jīng)實(shí)驗(yàn)證實(shí)，因此仍需采用各種體內(nèi)外的實(shí)驗(yàn)手段，如Northern雜交、改良5’ RACE法(modified 5’ -rapidamplification of cDNA ends),對(duì)預(yù)測(cè)的祀基因進(jìn)行--驗(yàn)證。這不僅費(fèi)時(shí)耗力，還大大地影響了標(biāo)靶基因的探索效率。 近二十多年來(lái),基于高通量分析的系統(tǒng)生物學(xué)(system biology)研究飛速發(fā)展，各種“組學(xué)(omics)”研究不斷拓展。如今科學(xué)家們能夠借助各種檢測(cè)手段把傳統(tǒng)的生物學(xué)研究從小規(guī)模、低效率模式提升至大規(guī)模并且精確高效的階段。針對(duì)上述的小分子RNA靶基因檢測(cè)，2008年出現(xiàn)了一種降解組測(cè)序(degradome sequencing)的檢測(cè)方法,也被稱(chēng)之為RNA末端平行分析法(parallel analysis of RNA ends)。它采用高通量測(cè)序技術(shù),對(duì)小分子RNA介導(dǎo)的靶基因mRNA剪切降解片段進(jìn)行深度測(cè)序分析，從結(jié)果中篩選小分子RNA作用的靶基因，并結(jié)合生物信息學(xué)分析，確定降解片段與小分子RNA精確的配對(duì)信息。該方法與其它傳統(tǒng)實(shí)驗(yàn)方法相比，可信度和檢測(cè)通量都得到了提高。但如今測(cè)序成本較高，由于不同組織中小分子RNA表達(dá)不一樣，其靶基因mRNA的降解情況也不一樣，如對(duì)多種樣品進(jìn)行檢測(cè)則價(jià)格昂貴。另外，現(xiàn)在的高通量測(cè)序獲得的片段較短，序列需進(jìn)行多次拼接，容易引入錯(cuò)誤。此外，已經(jīng)發(fā)展出的多種小分子RNA靶基因預(yù)測(cè)方法，測(cè)序不能對(duì)這些方法的預(yù)測(cè)結(jié)果進(jìn)行一一驗(yàn)證，容易造成靶基因檢測(cè)的遺漏，大大降低了降解組測(cè)序的性?xún)r(jià)比。常規(guī)的mRNA表達(dá)譜芯片能夠獲得不同組織中各個(gè)基因mRNA的表達(dá)情況，因此也能獲得生物信息學(xué)預(yù)測(cè)的小分子RNA靶基因的表達(dá)情況，并且也有一些實(shí)驗(yàn)室采用表達(dá)譜芯片來(lái)初步篩選小分子RNA的靶基因。但表達(dá)譜芯片獲得的mRNA表達(dá)情況并不一定與小分子RNA介導(dǎo)的靶基因mRNA降解相關(guān)，其表達(dá)也可能受到其它途徑的調(diào)控，因此通過(guò)表達(dá)譜芯片篩選的小分子RNA靶基因仍然無(wú)法區(qū)分真?zhèn)危孕枰捎玫屯康膶?shí)驗(yàn)手段進(jìn)行驗(yàn)證，也不是高通量鑒定小分子RNA介導(dǎo)的靶基因mRNA降解的理想方法。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
本專(zhuān)利技術(shù)的目的在于提供一種用于核酸降解組檢測(cè)的通用探針檢測(cè)方法，從而克服現(xiàn)有技術(shù)中的不足。為實(shí)現(xiàn)上述專(zhuān)利技術(shù)目的，本專(zhuān)利技術(shù)采用了如下技術(shù)方案: ，包括如下步驟: 1)采用生物信息學(xué)方法，預(yù)測(cè)可能被小分子RNA降解的目標(biāo)核酸降解組mRNA； 2)提供檢測(cè)探針，且至少所述檢測(cè)探針一端部的部分核酸序列與目標(biāo)核酸降解組mRNA斷裂處的核酸序列互補(bǔ)； 3)將所述檢測(cè)探針固定在生物芯片基質(zhì)上，形成生物芯片； 4)提取待檢測(cè)樣本RNA，并利用RNA連接酶在其5’端連接一段接頭，之后對(duì)該待檢測(cè)樣本RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄； 5)采用至少與所述接頭中的部分核酸序列互補(bǔ)的正向引物以及至少與步驟(4)所得反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的部分核酸序列互補(bǔ)的反向引物對(duì)所述反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行純化； 6)將步驟5)所得PCR擴(kuò)增產(chǎn)物和通用報(bào)告探針混入雜交液中與所述生物芯片雜交，其中，所述通用報(bào)告探針中至少部分核酸序列至少與所述待檢測(cè)樣本RNA接頭中緊鄰斷裂處的部分核酸序列互補(bǔ)； 7)洗滌雜交后的生物芯片，檢測(cè)雜交結(jié)果。作為優(yōu)選方案之一，所述檢測(cè)探針長(zhǎng)度為25-40mer，其中與目標(biāo)核酸降解組mRNA斷裂處的核酸序列互補(bǔ)的核酸序列長(zhǎng)度為15-30mer。作為優(yōu)選方案之一，該方法中對(duì)應(yīng)于每一目標(biāo)核酸降解組mRNA設(shè)計(jì)有一組探針池，每一組探針池包括復(fù)數(shù)個(gè)檢測(cè)探針，其中每個(gè)檢測(cè)探針對(duì)應(yīng)每一目標(biāo)核酸降解組mRNA的一個(gè)可能的斷裂位點(diǎn)。尤為優(yōu)選的，每一組探針池包括20個(gè)以上檢測(cè)探針。進(jìn)一步的講，所述檢測(cè)探針通過(guò)原位合成和/或化學(xué)鍵連接方式固定在生物芯片基質(zhì)上，所述化學(xué)鍵連接方式至少選自氨基-醛基反應(yīng)、靜電吸附、共價(jià)交聯(lián)中的任意一種。進(jìn)一步的講，所 述檢測(cè)樣本RNA包括總RNA樣品和/或富集poly(A)的RNA樣品。作為優(yōu)選方案之一，所述接頭包括RNA序列，其5’端修飾有用于防止與其它核酸在連接酶作用下發(fā)生連接的基團(tuán)，其3’端修飾有利于酶連的基團(tuán)。作為優(yōu)選方案之一，步驟4)中是利用含有poly (T)的反轉(zhuǎn)錄引物對(duì)待檢測(cè)樣本RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。作為優(yōu)選方案之一，步驟5)中PCR擴(kuò)增的循環(huán)數(shù)為5-15。作為優(yōu)選方案之一，所述通用報(bào)告探針長(zhǎng)度為3-12mer，其至少選自DNA、RNA、PNA和LNA中的任意一種。作為優(yōu)選方案之一，所述通用報(bào)告探針遠(yuǎn)離與所述待檢測(cè)樣本RNA接頭中緊鄰斷裂處的部分核酸序列互補(bǔ)的一端修飾有用于指示通用報(bào)告探針與待檢測(cè)樣本RNA反應(yīng)與否的標(biāo)記分子，例如，本領(lǐng)域技術(shù)人員習(xí)用的生物素，地高辛，熒光標(biāo)記，量子點(diǎn)，金顆粒、納米顆粒等。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本專(zhuān)利技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)在于:能夠高通量的檢測(cè)小分子RNA介導(dǎo)的靶基因mRNA降解產(chǎn)物，可對(duì)已被生物信息學(xué)預(yù)測(cè)到的大量靶基因進(jìn)行驗(yàn)證，是一種基于芯片技術(shù)的用于小分子RNA靶基因降解片段的檢測(cè)方法。附圖說(shuō)明圖1是利用miRNA降解靶基因mRNA的原理 圖2是本專(zhuān)利技術(shù)檢測(cè)核酸降解組mRNA的通用探針?lè)椒ǖ墓に嚵鞒虉D3是本專(zhuān)利技術(shù)實(shí)施例1中ptr-miR159f的靶基因XM_002297667的檢測(cè)結(jié)果。具體實(shí)施例方式本專(zhuān)利技術(shù)旨在提供一種高通量、低成本的用于小分子RNA靶基因降解片段檢測(cè)的通用探針檢測(cè)方法。進(jìn)一步的講，本專(zhuān)利技術(shù)的技術(shù)方案包括:提供一種基于堿基堆積雜交的用于核酸降解組檢測(cè)的通用探針檢測(cè)方法，其通過(guò)將被小分子RNA降解的核酸mRNA的可能斷裂位點(diǎn)放在堿基堆積作用處，檢測(cè)不同斷裂位點(diǎn)的檢測(cè)探針的熒光信號(hào)，只有當(dāng)檢測(cè)探針中的通用報(bào)告探針序列與斷裂位點(diǎn)緊鄰的情況下，通用報(bào)告探針才與該檢測(cè)探針發(fā)生雜交，即能檢測(cè)到降解核酸斷裂位點(diǎn)的準(zhǔn)確位置。前述的堿基堆積雜交(base stacking hybridization, BSH),也被稱(chēng)為臨近堆積雜交(contiguous stacking hybridizatio本文檔來(lái)自技高網(wǎng)...

【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
一種檢測(cè)核酸降解組的通用探針芯片方法，其特征在于，它包括如下步驟：1）采用生物信息學(xué)方法，預(yù)測(cè)可能被小分子RNA降解的目標(biāo)核酸降解組mRNA；2）提供檢測(cè)探針，且至少所述檢測(cè)探針一端部的部分核酸序列與目標(biāo)核酸降解組mRNA斷裂處的核酸序列互補(bǔ)；3）將所述檢測(cè)探針固定在生物芯片基質(zhì)上，形成生物芯片；4）提取待檢測(cè)樣本RNA，并利用RNA連接酶在其5’端連接一段接頭，之后對(duì)該待檢測(cè)樣本RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄；5）采用至少與所述接頭中的部分核酸序列互補(bǔ)的正向引物以及至少與步驟（4）所得反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的部分核酸序列互補(bǔ)的反向引物對(duì)所述反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行純化；6）將步驟5）所得PCR擴(kuò)增產(chǎn)物和通用報(bào)告探針混入雜交液中與所述生物芯片雜交，其中，所述通用報(bào)告探針中至少部分核酸序列至少與所述待檢測(cè)樣本RNA接頭中緊鄰斷裂處的部分核酸序列互補(bǔ)；7）洗滌雜交后的生物芯片，檢測(cè)雜交結(jié)果。

【技術(shù)特征摘要】
1.一種檢測(cè)核酸降解組的通用探針芯片方法，其特征在于，它包括如下步驟: 1)采用生物信息學(xué)方法，預(yù)測(cè)可能被小分子RNA降解的目標(biāo)核酸降解組mRNA； 2)提供檢測(cè)探針，且至少所述檢測(cè)探針一端部的部分核酸序列與目標(biāo)核酸降解組mRNA斷裂處的核酸序列互補(bǔ)； 3)將所述檢測(cè)探針固定在生物芯片基質(zhì)上，形成生物芯片； 4)提取待檢測(cè)樣本RNA，并利用RNA連接酶在其5’端連接一段接頭，之后對(duì)該待檢測(cè)樣本RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄； 5)采用至少與所述接頭中的部分核酸序列互補(bǔ)的正向引物以及至少與步驟(4)所得反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的部分核酸序列互補(bǔ)的反向引物對(duì)所述反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行純化； 6)將步驟5)所得PCR擴(kuò)增產(chǎn)物和通用報(bào)告探針混入雜交液中與所述生物芯片雜交，其中，所述通用報(bào)告探針中至少部分核酸序列至少與所述待檢測(cè)樣本RNA接頭中緊鄰斷裂處的部分核酸序列互補(bǔ)； 7)洗滌雜交后的生物芯片，檢測(cè)雜交結(jié)果。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測(cè)核酸降解組的通用探針芯片方法，其特征在于，所述檢測(cè)探針長(zhǎng)度為25-40mer，其中與目標(biāo)核酸降解組mRNA斷裂處的核酸序列互補(bǔ)的核酸序列長(zhǎng)度為15-30mer。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測(cè)核酸降解組的通用探針芯片方法，其特征在于，該方法中對(duì)應(yīng)于每一目標(biāo)核酸降解組mRNA設(shè)計(jì)有一組探針池,每一組探針池包括數(shù)個(gè)檢測(cè)探針，其中每個(gè)檢測(cè)探針對(duì)應(yīng)每一目標(biāo)核酸降解組mRNA的一個(gè)可能的斷裂位點(diǎn)。4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的檢...

【專(zhuān)利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：李炯，沈葉，鄭克孝，趙轉(zhuǎn)，
申請(qǐng)(專(zhuān)利權(quán))人：中國(guó)科學(xué)院蘇州納米技術(shù)與納米仿生研究所，
類(lèi)型：發(fā)明
國(guó)別省市：