增加甲硫氨酸得率制造技術

本發明專利技術涉及增加甲硫氨酸得率，具體地涉及通過在包含碳源和硫源的適當培養基中培養微生物來生產甲硫氨酸或其衍生物的方法。該微生物和/或該培養基經修飾，使得甲硫氨酸/碳源得率增加。本發明專利技術也描述了從發酵培養基中分離甲硫氨酸或其衍生物。

【技術實現步驟摘要】
增加甲硫氨酸得率本申請是申請日為2008年9月25日，申請號為“200880110059.9”(國際申請號為“PCT/EP2008/062859”)，名稱為“增加甲硫氨酸得率”的專利技術專利申請的分案申請。
本專利技術涉及一種通過在包含碳源和硫源的適宜培養基中培養微生物來生產甲硫氨酸及其衍生物的方法。該微生物和/或該培養基經修飾使得其甲硫氨酸/碳源得率增加。本專利技術還要求保護從發酵培養基中分離甲硫氨酸及其衍生物。
技術介紹
含硫化合物如半胱氨酸、高半胱氨酸、甲硫氨酸或S-腺苷甲硫氨酸對細胞代謝是關鍵的，并工業上生產用作食物或飼料添加劑以及藥物。尤其甲硫氨酸是一種動物無法合成的必需氨基酸，在許多身體功能中起著重要作用。除了它在蛋白質生物合成中的作用，甲硫氨酸也涉及轉甲基作用，以及硒與鋅的生物利用。甲硫氨酸還直接用作對于病癥如過敏與風濕熱的治療。然而，大部分生產出的甲硫氨酸添加于動物飼料。隨著動物來源的蛋白質因BSE與禽流感(chickenflu)的緣故而減少使用，對純甲硫氨酸的需求增加。D,L-甲硫氨酸通常自丙烯醛、甲硫醇以及氰化氫通過化學方法產生。然而，該外消旋混合物的性能并不像純L-甲硫氨酸一樣好，例如在雞飼料添加劑中(Saunderson,C.L.,(1985)BritishJournalofNutrition54,621-633)。純L-甲硫氨酸可自外消旋甲硫氨酸產生，例如通過酰基酶處理N-乙酰-D,L-甲硫氨酸來進行。這極大地提高了生產成本。對純L-甲硫氨酸需求增加，連同對環境的考慮，使甲硫氨酸的微生物生產具有吸引力。微生物發展出高度復雜的調控機制來調整細胞組分的生物合成，從而允許最大生長速率。結果，僅僅必需量的代謝物如氨基酸被合成，通常無法在野生型菌株的培養物上清中檢測到。細菌主要通過酶的反饋抑制及基因轉錄的阻抑或激活來控制氨基酸生物合成。在大部分情況下，這些調控途徑的效應物是相關途徑的終產物。因此，在微生物中過量生產氨基酸的策略要求對這些控制機制解除調控。在許多微生物中L-甲硫氨酸合成途徑眾所周知(圖1)。甲硫氨酸衍生自氨基酸天冬氨酸，但是其合成需要另外兩條途徑的合流(convergence)，即半胱氨酸生物合成與C1代謝。天冬氨酸自草酰乙酸合成。在大腸桿菌(E.coli)中，穩定的草酰乙酸儲備(pool)是檸檬酸循環的正常發揮功能所需的。因此將草酰乙酸轉化為天冬氨酸需要對從該儲備中移出草酰乙酸進行補償的反應。數種稱為添補反應(anapleroticreaction)的途徑，在大腸桿菌中實現了這些功能(Sauer&Eikmanns(2005)FEMSMicrobiolReviews29p76-94)。在指數生長條件及葡萄糖過剩的情況下，PEP羧化酶催化PEP的羧化產生草酰乙酸。羧化的效率取決于胞內PEP濃度及其他。PEP是參與多種反應的中心代謝物。這些反應之一，PEP糖酵解轉化為丙酮酸對大腸桿菌不是必需的，因為葡萄糖通過PTS系統攝入可將產自葡萄糖的兩個PEP分子之一轉化為丙酮酸。在糖酵解中，酶丙酮酸激酶(其在大腸桿菌由基因pykA和pykF編碼的兩個同工酶編碼)催化PEP轉化為丙酮酸。天冬氨酸通過順序的三個反應轉化為高絲氨酸。高絲氨酸可隨后進入蘇氨酸/異亮氨酸或甲硫氨酸生物合成途徑。在大腸桿菌中，進入甲硫氨酸途徑需要將高絲氨酸酰化為琥珀酰高絲氨酸。這個激活步驟允許隨后與半胱氨酸縮合，生成含有硫醚的胱硫醚。胱硫醚水解生成高半胱氨酸。生成甲硫氨酸的最后甲基轉移通過B12-依賴或B12-非依賴的甲基轉移酶進行。在大腸桿菌中，甲硫氨酸生物合成通過阻抑和激活甲硫氨酸生物合成基因分別經由MetJ和MetR的蛋白來調控(在FiggeRM(2006),WendischVF編,MicrobiolMonogr(5)Aminoacidbiosynthesisp164-185的綜述)。已知MetJ連同其共阻抑物S-腺苷甲硫氨酸調控基因metA、metB、metC、metE和metF。MetR在其共激活子高半胱氨酸的存在下激活編碼涉及甲硫氨酸生成的酶的其它基因，如glyA、metE、metH和metF，而metA僅在高半胱氨酸不存在時被MetR激活。所有這些酶參與C1單元的產生及其從絲氨酸到甲硫氨酸的轉移。編碼絲氨酸羥甲基轉移酶的GlyA催化絲氨酸到甘氨酸的轉化，以及C1單元在輔酶四氫葉酸(THF)上的伴隨轉移。甘氨酸可隨即轉化為CO2、NH3，而另一個C1單元轉移到THF上。該反應受到由基因gcvTHP和lpd編碼的甘氨酸裂解復合物催化。由上述兩個反應所產生亞甲基-THF形式的C1單元可隨后還原為甲基-THF或進一步氧化為甲酰-THF。甲硫氨酸生物合成需要還原為甲基-THF。因此氧化反應與甲硫氨酸生物合成競爭C1單元。甲酰-THF或甲酸對嘌呤和組氨酸的生物合成是必需的。在大腸桿菌中，在通過由purU基因編碼的甲酰基-THF脫甲酰基酶催化的反應中，甲酰-THF可轉化為THF及游離的甲酸(Nagy等(1995)J.Bacteriol177(5)p.1292-98)。亞甲基-THF到甲基-THF的還原由MetF蛋白催化。甲基到高半胱氨酸上的轉移由MetH通過維生素B12或直接由MetE催化。已知MetH酶的催化速率是MetE酶的一百倍。當缺乏維生素B12因而缺乏活性MetH時，MetE可構成多至5%的總細胞蛋白。活性MetH的存在降低MetE的活性，可能是通過降低通常經由MetR激活metE轉錄的高半胱氨酸的量來進行。因此，通過MetH產生甲硫氨酸為細胞節約了重要的資源，因為MetE并非大量表達。高半胱氨酸的積累對大腸桿菌是有毒的(Tuite等,2005J.Bacteriol,187,13,4362-4371.)，而且同時對經由MetR的metA表達具有負面的調控效應。因此，顯然酶MetH和/或MetE的強表達對有效的甲硫氨酸生成是必需的。在大腸桿菌中，還原的硫整合至半胱氨酸中，并隨即轉移到甲硫氨酸前體O-琥珀酰-高絲氨酸上，該過程稱為轉硫化作用(在Neidhardt,F.C.(主編),R.CurtissIII,J.L.Ingraham,E.C.C.Lin,K.B.Low，B.Magasanik,W.S.Reznikoff，M.Riley,M.Schaechter,和H.E.Umbarger(編).1996.EscherichiacoliandSalmonella:CellularandMolecularBiology.AmericanSocietyforMicrobiology中綜述)。半胱氨酸通過硫氫化反應由O-乙酰絲氨酸和H2S產生。該過程受到其產物半胱氨酸的負反饋調控，半胱氨酸作用于由cysE編碼的絲氨酸轉乙酰酶。N-乙酰絲氨酸(其由O-乙酰絲氨酸自發產生)與轉錄因子CysB一同激活編碼參與如下的酶的基因：含硫化合物的運輸，它們變為H2S的還原及它們在有機硫化合物半胱氨酸(其與甲硫氨酸一樣是必需氨基酸)中的整合。在缺乏半胱氨酸時，MetB催化甲硫氨酸前體O-琥珀酰高絲氨酸轉化為氨、α-酮丁酸及琥珀酸，該反應稱為γ-消去(Aitken&Kirsch,2005,ArchBiochemBio本文檔來自技高網...

【技術保護點】
修飾的微生物，其具有增加的甲硫氨酸/碳源得率，其中基因purU缺失。

【技術特征摘要】
2007.10.02 EP PCT/EP2007/0604331.一種在發酵工藝中產生甲硫氨酸及其衍生物的方法，包括以下步驟：-在包含碳源與硫源的適當培養基中培養來自大腸桿菌的種的經修飾的微生物，和-從所述培養基中回收甲硫氨酸，其中與來自大腸桿菌的種的未修飾的微生物相比，該經修飾的微生物通過缺失基因purU呈現降低的甲酰-THF的脫甲酰化，而且通過在所述培養基中對該經修飾的微生物限制磷酸鹽或使其缺乏磷酸鹽來限制所述微生物的生長。2.權利要求1的方法，其中還通過PEP消耗的減少修飾該微生物，所述PEP消耗的減少通過削弱pykA基因和/或pykF基因的表達而獲得。3.權利要求1的方法，其中通過在所述培養基中對該經修飾的微生物進一步限制鉀或使其缺乏鉀來限制所述微生物的生長。4.權利要求1的方法，其中通過削弱pykA和/或pykF基因的表達來減少PEP的消耗，而且其中在所述培養基中對該微生物進一步限制鉀或使其缺乏鉀來限制所述微生物的生長。5.權利要求1-4中任一項的方法，其中在該經修飾的微生物中下列至少一個基因的表達增加：cysP、cysU、cysW、cysA、cysM、cysJ、cysI、cysH、cysE、gcvT、gcvH、gcvP、lpd、serA、serB、serC、glyA。6.權利要求5的方法，其中在該微生物中操縱子cysPUWAM和/或cysJIH的表達增加。7.權利要求5的方法，其中在該微生物中由基因gcvTHP和/或lpd編碼的甘氨酸裂解復合物的表達增加。8.權利要求5的方法，其中至少一個涉及甘氨酸生物合成途徑的基因過表達。9.權利要求8的方法，其中...

【專利技術屬性】
技術研發人員：雷納菲格，菲利普蘇凱勒，吉勞姆巴比爾，格溫耐爾貝斯特爾科雷，錫德里克博伊薩特，米歇爾查蒂厄，
申請(專利權)人：代謝探索者公司，
類型：發明
國別省市：