一種透性化與超聲聯用的功能微生物轉化方法技術

本發明專利技術公開了一種透性化與超聲聯用的功能微生物轉化方法，采用Decon溶液對微生物細胞進行透性化處理，降低細胞壁和細胞質膜的磷脂含量；在透性化處理的同時，通過向體系添加鈣離子，幫助外源DNA沉降和輸運；然后施加低頻超聲波20-80kHz，將欲轉化的脫氧核糖核酸和核糖核酸輸運至細胞內；采用Decon透性化處理后，超聲轉化時超聲的功率可以相應降低、超聲時間縮短，降低了超聲對細胞的損傷；通過合理的選擇透性轉化試劑及確定相應濃度，得到一種同時滿足透性化處理與超聲轉化技術的介質溶液；能夠實現對更大范圍的宿主菌進行外源核酸分子轉化并且提高轉化效率，從而為遺傳工程改造和新的功能微生物培育提供有效的技術手段，提高效率并降低成本和操作難度。

【技術實現步驟摘要】

本專利技術屬于遺傳工程與細胞工程
，，具體涉及。
技術介紹
細菌通過吸收外源DNA而獲得新的遺傳性狀的過程被稱為轉化。將外源DNA分子如質粒或雙鏈DNA導入細菌細胞是微生物學和分子生物學最基礎的技術手段之一，也是對微生物進行遺傳工程改造的關鍵過程之一。經過數十年的研究，對一些模式微生物體系已經有相應的較為高效的DNA轉化方法，比如對大腸桿菌體系，制備感受態細胞后通過熱應激方法轉化效率可以達到10_5或10_6。針對非特異的微生物宿主，也研究和開發了適用面更廣的技術，其中高壓電穿孔法和接合法是最常見的手段，但兩者都有其局限性。接合法需要細菌間的物理接觸以形成細胞-菌毛-細胞結合形式，若細胞不具備菌毛結構則無法實現轉化。高壓電穿孔須要低離子強度的反應體系和幾千伏的高電壓，條件極為苛刻，對細胞的損傷較大，更不利于更大范圍內普及使用，電穿孔儀數十萬元的價格也限制了其應用。超聲波指頻率高于20kHz的聲波，具有很強的能量。當超聲波作用于溶液時，會產生幾百大氣壓的局部高壓以及上千度的局部高溫，通常超聲波的這種作用稱為氣穴作用。超聲波作用下，細胞壁的穿透性增強。由于上述特點，近十年里有不少研究通過高頻超聲波(頻率大于IOOkHz)向細胞內轉移藥物與DNA，實現癌癥或腫瘤的基因療法，在這些研究中，轉化的受體細胞均為真核細胞。但當受體細胞為細菌等原核微生物時，高頻超聲波并未表現出明顯效果。然而通過低頻超聲波向原核微生物進行DNA轉化在近五年里取得了突破。有研究表明，在合適的條件下，使用40kHz超聲波可以對好氧的革蘭氏陰性菌如惡臭假單胞菌、大腸桿菌，或厭氧的革蘭氏陽性菌如嗜熱厭氧乙醇桿等進行DNA轉化。然而對于厭氧的革蘭氏陰性菌，目前尚無對應的超聲轉化方法付諸實施，更重要的是，單純的超聲轉化盡管可以將轉化效率提高到1(Γ6的數量級，但與商業化的電轉化10_5以上的轉化效率相比仍然較低。由于超聲轉化技術出現時間較短，對其研究尚不深入，該技術是否能與其他的技術手段相結合對學術界和工業界仍屬于空白。因此如何改造現有的超聲轉化技術，并將其與其他技術有效的結合，從而開發新的DNA轉化技術，對于提高轉化操作的成功率，新功能微生物克隆和培育，具有非常重要的意義。
技術實現思路
為了解決上述現有技術中存在的缺陷，本專利技術的目的在于提供，能夠實現對更大范圍的宿主菌進行DNA轉化并且提高轉化效率，從而為遺傳工程改造和新的功能微生物培育提供有效的技術手段，提高效率并降低成本和操作難度。為達到上述目的，本專利技術所采用的技術方案是:一種透性 化與超聲聯用的功能微生物轉化方法，包括如下步驟:I)在液體培養基中培養微生物，使其進入對數生長期，得到菌液；2)對菌液離心，并以透性轉化試劑重懸，控制透性轉化試劑的用量，使細胞濃度在此過程中濃縮5-20倍，進行細胞透性化處理；3)將經透性化處理的微生物離心后重懸于透性轉化試劑，并置于轉化用的玻璃瓶；4)在玻璃瓶中加入欲轉化的外源核酸分子后，將玻璃瓶置于超聲波儀器中，施加頻率為20-80kHz的超聲，超聲采用連續或間歇式；5)微生物復蘇，在選擇性培養基上進行轉化體篩選。步驟I)所述的微生物為好氧菌或厭氧菌。所述的厭氧菌包括脫硫弧菌Desulfovibrio vulgaris,好氧菌包括惡臭假單胞菌Pseudomonas putida。步驟2)中加入的透性轉化試劑為Decon、氯化鈣與磷酸緩沖溶液的混合液，Decon濃度為0.5%-4% (體積百分比)；氯化鈣最終濃度為IO-1OOm mol/L。步驟2)所述的透性化處理的時間為10_40min。步驟4)加入的外源核酸分子包括線性DNA、環狀DNA、RNA中的一種或多種。步驟4)中加入的外源核酸分子濃度存在最優范圍，當細胞濃度固定時，核酸分子濃度在一定范圍內提高，則每個細胞對應的核酸分子數相應提高，二者碰撞概率增加，轉化效率提高；但當核酸分子濃度進一步提高時，核酸在細胞壁附近的空間位阻增大，導致轉化效率下降。步驟4)中加入的外源核酸分子最優濃度按如下公式計算:Cp=L 53 X Cb X NbpXKT19式中，Cp為核酸分子濃度(gL)，Cb為受體細胞濃度(個/L)，Nbp為核酸分子的堿基對數目，若加入多種，則每種均按照上述公式計算最優濃度。步驟4的超聲施加時間為5-60s。與現有技術相比，本專利技術具有如下優點:本專利技術采用Decon溶液對微生物細胞進行透性化處理，降低細胞壁和細胞質膜的磷脂含量；在透性化處理的同時，通過向體系添加鈣離子，幫助外源核酸分子沉降和輸運；然后施加低頻超聲波(20-80kHz)在微生物細胞表面產生瞬時囊泡，將欲轉化的脫氧核糖核酸和核糖核酸輸運至細胞內。由于超聲波對細胞具有破壞性，長時間的超聲會造成細胞損傷從而導致轉化效率下降。采用Decon對細胞進行透性化處理后，超聲轉化時超聲的功率可以相應降低、超聲時間縮短，降低了超聲對細胞的損傷。與目前常用的乙醇透性化處理技術相比，本專利技術中所采用的Decon濃度條件下，對細胞的殺菌作用較弱，因此通過合理的調配，可以獲得同時優化應用于細胞透性化與超聲轉化的介質溶液，而采用乙醇為主要透性化成分的溶液在超聲時將使大量乙醇進入細胞膜內部，從而導致細胞死亡或活性抑制，因此難以得到一種同時滿足透性化處理與超聲轉化技術的介質溶液。本專利技術的另一重要前景在于功率較低的超聲發生裝置更容易實現工程的擴大化，因此在大規模的原位微生物轉化時(如污水處理廠曝氣池內施加超聲，使活性污泥中的微生物捕獲新的降解功能)，具有更大的應用前景。 本專利技術的創新性在于尋找到了新的透性轉化試劑，該試劑能提高細胞壁及細胞膜的穿透性，而同時又不影響超聲轉化的過程，且能在一定程度上維持細胞的活性及存活率。通過應用該透性轉化試劑，首次實現了將細胞的透性化處理技術和現有的低頻超聲轉化技術的有機的結合，創造性的提出了透性化-超聲轉化的新技術，并且對超聲轉化時外源核酸分子濃度與細胞濃度的最優配比給出了定量化的計算公式。同時該技術在厭氧的革蘭氏陰性菌中的應用也屬于本專利技術的創新點之一。附圖說明圖1是經透性轉化介質處理后的脫硫弧菌DvH與未經透性轉化介質處理的細胞電鏡照片的對比圖。其中左圖是未經透性處理的細胞，右圖是經過含有1%的Decon的透性試劑處理的細胞。圖2是對脫硫弧菌DvH進行透性化-超聲聯合技術進行DNA轉化后的轉化效率柱狀圖。圖3是幾種轉化技術對惡臭假單胞菌KT2440進行質粒轉化的效率對比圖。具體實施例方式下面結合附圖和具體實施方式對本專利技術作進一步詳細說明。實施例1:透性化-超聲轉化技術對脫硫弧菌DesulfovibriovuIgarisHi Idenborough 進行轉化的方法: 如無特殊說明，所有的操作在無菌厭氧條件下進行。I)細胞培養:脫硫弧菌Desulfovibriovulgaris HiIdenborough(以下簡稱DvH)是一株厭氧的革蘭氏陰性菌，公眾可通過德國微生物保藏和細胞培養中心(DSMZ，菌種編號DSM 644)獲得，培養基采用Medium 63 (配制方法參考DSMZ網站說明)。現有對DvH菌的轉化技術中，僅有電轉化被報道能成功向該菌進行DNA轉化。將細菌接種至50mL Medium63培養基，在30 35°C溫度下本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種透性化與超聲聯用的功能微生物轉化方法，其特征在于：包括如下步驟：1）在液體培養基中培養微生物，使其進入對數生長期，得到菌液；2）對菌液離心，并以透性轉化試劑重懸，控制透性轉化試劑的用量，使細胞濃度在此過程中濃縮5?20倍，進行細胞透性化處理；3）將經透性化處理的微生物離心后重懸于透性轉化試劑，并置于轉化用的玻璃瓶；4）在玻璃瓶中加入欲轉化的外源核酸分子后，將玻璃瓶置于超聲波儀器中，施加頻率為20?80kHz的超聲，超聲采用連續或間歇式；5）微生物復蘇，在選擇性培養基上進行轉化體篩選。

【技術特征摘要】
1.一種透性化與超聲聯用的功能微生物轉化方法，其特征在于:包括如下步驟: 1)在液體培養基中培養微生物，使其進入對數生長期，得到菌液； 2)對菌液離心，并以透性轉化試劑重懸，控制透性轉化試劑的用量，使細胞濃度在此過程中濃縮5-20倍，進行細胞透性化處理； 3)將經透性化處理的微生物離心后重懸于透性轉化試劑，并置于轉化用的玻璃瓶； 4)在玻璃瓶中加入欲轉化的外源核酸分子后，將玻璃瓶置于超聲波儀器中，施加頻率為20-80kHz的超聲，超聲采用連續或間歇式； 5)微生物復蘇，在選擇 性培養基上進行轉化體篩選。2.根據權利要求1所述的透性化與超聲聯用的功能微生物轉化方法，步驟I)所述的微生物為好氧菌或厭氧菌。3.根據權利要求2所述的透性化與超聲聯用的功能微生物轉化方法，所述的厭氧菌包括脫硫弧菌Desulfovibrio vulgaris,好氧菌包括惡臭假單胞菌Pseudomonas putida。4.根據權利要求1所述的透性化與超...

【專利技術屬性】
技術研發人員：宋一之，
申請(專利權)人：宋一之，
類型：發明
國別省市：