本發明專利技術涉及病毒載體，其包括編碼HIV多肽的寡核苷酸，更具體地，其中所述病毒是腺病毒。具體而言，此類腺病毒是非人類的靈長類動物腺病毒，諸如猿猴腺病毒，更具體地，黑猩猩腺病毒。具體而言，本發明專利技術涉及腺病毒載體，其包括編碼多種不同HIV抗原的HIV多核苷酸序列，例如兩種或三種或者更多種的HIV抗原。本發明專利技術進一步涉及制備所述病毒載體的方法，涉及由此方法制備的病毒載體，并涉及所述載體在醫藥，尤其是在預防性或治療性疫苗接種方面的用途。
【技術實現步驟摘要】
本專利技術涉及病毒載體，包括編碼HIV多肽的寡核苷酸，更具體地，其中所述病毒載體是腺病毒。具體而言，此類腺病毒是非人靈長類動物腺病毒，諸如猿猴腺病毒(simianadenovirus)，更具體地，是黑猩猩腺病毒。具體而言，本專利技術涉及包括HIV多核苷酸序列的腺病毒載體，該序列編碼多種不同的HIV抗原，例如，兩種或三種或者更多種HIV抗原。本專利技術進一步涉及制備所述病毒載體的方法，涉及通過本方法所制備的病毒載體，并涉及所述載體在醫藥，尤其是在預防性或者治療性疫苗接種方面的用途。HIV-1是導致獲得性免疫缺陷綜合征(the acquired immunedef iciencysyndrome,AIDS)的主要原因，該病癥被認為是世界上的主要健康問題之一。盡管在世界范圍內已進行了廣泛的研究，但生產疫苗的努力至今尚未獲得成功。HIV-1是反轉錄病毒科的一種RNA病毒。HIV基因組編碼至少九種蛋白，其被劃分為三個種類:主要的結構蛋白Gag、Pol和Env,調控蛋白Tat和Rev,以及輔助蛋白(accessory proteins) Vpu、Vpr、Vif和Nef。HIV基因組顯示了所有反轉錄病毒的5' LTR-gag-pol-env-LTR3'組織方式。腺病毒是一種雙鏈DNA病毒，基因組大小大約36kb，由于其具有在多種靶組織中獲得高效基因轉移的能力以及巨大的轉基因容量而被廣泛地用于基因轉移。按常規，腺病毒的El基因缺失，并用轉基因盒替換，該 轉基因盒由所選的啟動子、感興趣基因的cDNA序列和polyA信號組成，從而產生復制缺陷型重組病毒。腺病毒具有典型的二十面體衣殼形態，其包括三種主要的蛋白，六鄰體(hexon)(II)、五鄰體基底(penton base) (III)和具圓柄的纖維(IV)，以及大量的其它次要蛋白V1、VII1、IX、IIIa 和 IVa2 (Russell ff.C.2000, Gen Virol, 81:2573-2604)。該病毒的基因組是線性雙鏈DNA，5'末端與末端蛋白共價結合，所述5'末端具有反向末端重復序列(invertedterminal repeats, ITRs)。病毒DNA與高堿性蛋白VII以及被命名為mu小肽緊密結合。另一種蛋白，V，與此DNA-蛋白復合體包裝在一起，并通過蛋白VI提供了一種連接至衣殼的結構鏈。此病毒同樣包含病毒編碼的蛋白酶，其對于加工一些結構蛋白以產生出成熟的傳染性病毒而言是必要的。100種以上不同血清型的腺病毒已被分離出來，其感染不同種類的哺乳動物，其中51種是人類起源的。此類人類起源的腺病毒實例為Ad1、Ad2、Ad4、Ad5、Ad6、AdlU Ad24、Ad34、Ad35。人類的血清型根據一些生物學、化學、免疫學和結構標準已被劃分為六個亞類(A-F)[第一頁，W004018627]。盡管基于Ad5的載體已在大量的基因治療試驗中被廣泛地使用，但是由于自然感染而在總體人群中預先存在的免疫性，使得Ad5以及其它C組腺病毒載體的使用可能受到限制。Ad5以及其它C組成員容易成為血清陽性率最高的血清型之一。對現有載體的免疫性可能由于在治療期間暴露于該載體而得以發展。此類對血清陽性載體的預先存在的或者發展的免疫性可能會限制基因治療或者接種疫苗努力的功效。因此，在尋找能夠規避宿主免疫反應的基因遞送系統時，可選的腺病毒血清型構成了非常重要的靶標。可選血清型的一種此類范圍是非人靈長類動物的腺病毒，尤其是黑猩猩腺病毒。參見美國專利6，083，716，其描述了兩種黑猩猩腺病毒的基因組。已表明黑猩猩(Pan或C)腺病毒載體如同人腺病毒載體一樣有效地誘導對轉基因產物的強烈的免疫反應(Fitzgerald et al.J.1mmunol.170:1416)。HIV Tat和Nef蛋白是早期蛋白，即它們是在感染的早期，在缺乏結構蛋白的情況下表達。Nef基因編碼一種早期的輔助性HIV蛋白，其已被表明具有若干種活性。例如，已知Nef蛋白能夠引起CD4，HIV受體，從細胞表面的清除，盡管此功能的生物學重要性還有爭議。此外，Nef與T細胞的信號通路相互作用并誘導了一種活化狀態，此狀態反過來可以促進更有效的基因表達。一些HIV分離物在此區域內具有突變，其致使它們無法編碼功能蛋白并導致其在體內復制和致病過程中嚴重受損。Gag基因是由全長RNA翻譯而來，以產生一種前體多聚蛋白，其隨后被剪切成3_5種衣殼蛋白；基質蛋白、衣殼蛋白和核酸結合蛋白以及蛋白酶。(Fundamental Virology,Fields BN, Knipe DM and HowleyM 19962.Fields Virology vol 21996)。Gag基因產生出55-千道爾頓(kD)的Gag前體蛋白，也被稱為p55，其由未經剪接的病毒mRNA表達。在翻譯過程中，p55的N末端被豆蘧酰化，這引發了其與細胞膜胞質面的結合。膜結合的Gag多聚蛋白募集了病毒基因組RNA的兩個拷貝，以及其它病毒蛋白和細胞蛋白，這引發了病毒顆粒從感染細胞的表面出芽。出芽后，在病毒成熟期間P55被病毒編碼的蛋白酶(Pol基因的產物)切割為四種更小的蛋白，被命名為MA(基質matrix[pl7])、CA (衣殼 capsid[p24])、NC(核殼體 nucleocapsid[p9])和 ρ6.(4)。 除三種主要的Gag蛋白(pl7，p24and p9)之外，所有Gag前體都含有若干個其它區域，其被切割下來并作為各種大小的肽保留在病毒粒子中。這些蛋白具有不同的作用，例如P2蛋白被提出在調節蛋白酶活性方面具有作用，并且有助于對蛋白水解加工進行正確的時間選擇。MA多肽來源于p55的N-端，豆蘧酰化末端。大多數MA分子保持連接于病毒粒子脂雙層的內表面，使該病毒顆粒穩定。一套(subset)MA在病毒粒子更深層的內部被募集，在其中它成為復合物的一部分，該復合物護送病毒DNA至細胞核。這些MA分子促進了病毒基因組的核轉運，因為MA上的親細胞核信號被細胞的核輸入機器所識別。此現象使HIV能夠感染不發生分裂的細胞，對反轉錄病毒而言是一種不尋常的特性。p24(CA)蛋白構成病毒顆粒的圓錐形核心。親環蛋白A(CyclophilinA)已被證實與p55的p24區域相互作用，導致其整合入HIV顆粒中。Gag與親環蛋白A之間的相互作用是必不可少的，因為通過環孢菌素A破壞這種相互作用抑制了病毒的復制。Gag的NC區負責特異性地識別所謂HIV包裝信號。該包裝信號由定位于病毒RNA5'末端附近的四個莖環結構組成，并且足以介導將異源RNA整合進HIV-1病毒粒子中。NC通過由兩個鋅指基元介導的相互作用而結合于包裝信號。NC同樣有助于反轉錄過程。p6多肽區介導p55Gag和輔助蛋白Vpr之間的相互作用，導致Vpr被整合入裝配中的病毒粒子。p6區同樣含有所謂的晚期結構域(Iatedomain)，其是出芽的病毒粒子從感染細胞中有效釋放所必需的。Pol基因編碼三種具有病毒早期感染所需活性的蛋白，反轉錄酶RT、蛋白酶以及使病毒DNA整合入細胞DNA所需的整合酶蛋白。Pol的初級產物被病毒粒子的蛋白酶切割以產生氨基末端的RT肽，其含有DNA合成所需的活性(RNA和DNA本文檔來自技高網...
【技術保護點】
一種腺病毒載體，包括編碼至少HIV抗原RT、Nef和Gag或者它們的免疫原性片段的一種或多種多核苷酸，所述多核苷酸被如此安排以便使它們按照Gag、RT、Nef的順序被轉錄，其特征在于所述病毒是E1和/或E3缺失的Pan6或Pan7腺病毒。
【技術特征摘要】
2005.05.12 US 60/6803891.一種腺病毒載體，包括編碼至少Hiv抗原RT、Nef和Gag或者它們的免疫原性片段的一種或多種多核苷酸，所述多核苷酸被如此安排以便使它們按照Gag、RT、Nef的順序被轉錄，其特征在于所述病毒是El和/或E3缺失的Pan6或Pan7腺病毒。2.根據權利要求1所述的腺病毒載體，其中所述RT是被截短的。3.根據權利要求1所述的腺病毒載體，其中所述Nef是被截短的。4.根據權利要求1至3任一項所述的腺病毒載體，其中所述Gag只是pl7和p24。5.根據權利要求1至3中任一項所述的腺病毒載體，其中所述的一種或多種HIV多核苷酸的大小使得所述載體的總體大小為所述病毒大小的90至100%。6.根據權利要求1至3中任一項所述的腺病毒載體，其中編碼所述HIV抗原的多核苷酸序列被安排為融合形式。7.根據權利要求...
【專利技術屬性】
技術研發人員：PF埃爾特爾，JP蒂特，CA范維利，
申請(專利權)人：葛蘭素集團有限公司，
類型：發明
國別省市：
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