本發明專利技術公開了一種雜交鵝掌楸高效遺傳轉化方法，包括：雜交鵝掌楸轉化受體的建立、農桿菌制備、侵染、脫菌培養和篩選培養。本發明專利技術以雜交鵝掌楸懸浮培養的單細胞作為遺傳轉化受體系統，通過農桿菌介導的方法，以GUS基因為報告基因，通過細胞學方法檢測GUS基因的瞬間表達、長期表達、通過分子生物學方法檢測等確定外源基因的高效轉化。本發明專利技術采用雜交鵝掌楸單細胞起源的體細胞胚胎發生體系，有利于外源基因的導入，并降低了嵌合體的產生。
【技術實現步驟摘要】
本專利技術涉及雜交鵝掌楸遺傳轉化方法，具體涉及。
技術介紹
雜交鵝掌楸又名鵝掌楸(馬褂木)，它是由南京林業大學葉培忠教授等首次通過人工雜交的方法，將分布在亞洲的中國雜交鵝掌楸與分布在北美洲的北美雜交鵝掌楸采用人工控制授粉方法育成的雜交樹種。雜交鵝掌楸葉形奇特，花色艷麗，是優良的庭院栽培和園林觀賞樹種。同時，其樹體高大，主干圓滿通直，木材結構細致均勻，色淺，易干燥，易加工，纖維較長，是優良的制漿造紙、人造板及家具用材樹種，社會需求量極大。但是雜交鵝掌楸生長周期長，應用常規手段育種具有較大的困難。因此必須依靠現代生物技術并與常規育種相結合，進而縮短育種周期，加速育種進程，營造優質人工林，緩解木材供需矛盾。基因工程是生物技術的核心，為林木遺傳改良開辟了一條新的途徑。林木基因工程是通過適合的基因轉移技術，導入有用的外源基因，獲得轉基因植株，進行林木遺傳改良或有關的研究。近年來，林木基因工程取得了較大的進展。目前，已有幾百種植物得到遺傳改良，在豐產，抗病，抗寒等領域廣泛應用。農桿菌介導的遺傳轉化是外源DNA進入植物細胞最成功和應用最為廣泛的方法，自1976年D.Cleene和D.Ley (1976)首次報導根癌農桿菌菌株B6 (LMG18)也能感染裸子植物受傷組織并產生冠癭瘤(Crown gall)后，許多學者開始利用農桿菌進行木本植物的基因轉移。在農桿菌介導的遺傳轉化過 程中，成功的基因轉化首先依賴于良好的植物受體系統的建立。所謂植物基因轉化受體系統，是指用于轉化的外植體通過組織培養途徑或其他非組織培養途徑，能高效、穩定地再生無性系，并能接受外源DNA整合，對轉化選擇抗生素敏感的再生系統。目前，以植物體胚發生體系或體胚作為受體系統越來越受到重視。該系統的主要特點有四點:其一、組成胚狀體的胚性細胞接受外源DNA能力很強，是理想的基因轉化感受態細胞，而且這些細胞繁殖量大，同步性好，因此轉化率很高；其二、胚狀體個體間遺傳背景一致，無性系變異小，成苗快，數量多，而且還可以制成人工種子，有利于轉基因植株的生產和推廣；其三、胚狀體多為單細胞起源，轉化獲得的轉基因植株嵌合體少；其四、胚狀體具有兩極，在發育過程中同時可分化出芽和根，形成完整的植株，減少了不定芽發育過程中生根困難的難題。
技術實現思路
專利技術目的:針對現有技術中存在的不足，本專利技術的目的是提供，以建立穩定高效的雜交鵝掌楸遺傳轉化體系。技術方案:為了實現上述專利技術目的，本專利技術采用的技術方案如下: ，包括以下步驟:(O雜交鵝掌楸轉化受體的建立:取繼代2周的雜交鵝掌楸愈傷組織細胞，接入含有M13雜交鵝掌楸液體培養基的三角瓶中，230C，95r/min的恒溫搖床振蕩培養；每7天繼代一次，繼代3次后建立出懸浮細胞系，即為雜交鵝掌楸轉化受體； (2)農桿菌制備:先活化EHA105單菌落，在含有卡那霉素50mg/L、鏈霉素30mg/L的LB液體培養基中，28°C，280r/min振蕩培養至0D_為0.6-0.8，4°C離心收集菌體，用雜交鵝掌楸液體繼代培養基重懸菌體，將菌液濃度稀釋至0.5左右； (3)侵染:取3ml菌液加到雜交鵝掌楸轉化受體中，并加入乙酰丁香酮ΙΟΟμπιοΙ/L。靜置l-3min后，置于23°C、95r/min的恒溫搖床中，繼續振蕩培養16 40h ； (4)脫菌培養:將雜交鵝掌楸懸浮細胞經400目及150目的篩子過篩，用雜交鵝掌楸單細胞培養基將400目的篩子上的單細胞懸浮，置于23°C、95r/min的恒溫搖床，振蕩培養培養36h后，再用400目的篩子過篩一次，并用加有頭孢霉素500mg/L的雜交鵝掌楸單細胞培養基將400目篩子上的單細胞收集。并將單細胞以2mL每皿的濃度鋪平板，培養基為加有頭孢霉素500mg/L，約21天繼代一次；繼代一次后，可以觀察到子葉胚； (5)篩選培養:待子葉胚成熟，并長到2cm左右，將其挑出，轉到MS基本培養基上生長，其中加有頭孢霉素200mg/L，卡那霉素50mg/L。步驟(1)中，取繼代2周的雜交鵝掌楸愈傷組織細胞5mL，將其接種到250mL的三角瓶中，并在瓶壁輕輕敲散；量取50mL雜交鵝掌楸Ml3液體培養基加入三角瓶中，將材料置于23°C,95r/min的恒溫搖床振蕩培養。步驟(2)中，農桿菌制備，具體操作為: 1)將_70°C保存的EHA105菌液在冰上融化，用接種環蘸取少量菌液，接種到含有卡那霉素50mg/L，鏈霉素30mg/L的LB培養基上，將其置于28°C恒溫培養箱中培養； 2)待其長出單菌落后，用接種環挑取單菌落，接種到含有卡那霉素50mg/L，鏈霉素30mg/L的LB培養基上,再活化一次,然后將其置于28°C恒溫培養箱中培養； 3)待其長出單菌落后，用滅過菌的槍頭挑取單菌落接種到含有IOmL加有卡那霉素50mg/L，鏈霉素30mg/L的LB液體培養基的三角瓶中，28°C、220r/min振蕩培養； 4)約20h后，吸取2mL菌液，接種到含有50mL加有適量抗生素的LB液體培養基的三角瓶中，28°C、280r/min 振蕩培養至 OD600 為 0.6-0.8 ； 5)待農桿菌培養到OD6tltl為0.6-0.8時，取25mL菌液于50mL離心管中，于5000r/min，4°C離心IOmin,去除上清,收集菌體； 6)用雜交鵝掌楸液體繼代培養基重懸菌體，將菌液濃度稀釋至0.5左右。步驟(3 )中，共培養36 40h。所述的EHA105帶有35S:⑶S基因和NPT-1I基因。步驟(5 )中，每21天繼代一次，繼代2次后，就可用于移栽。有益效果:與現有技術相比，本專利技術以雜交鵝掌楸懸浮培養的單細胞作為遺傳轉化受體系統，通過農桿菌介導的方法，以GUS基因為報告基因，通過細胞學方法檢測GUS基因的瞬間表達、長期表達、通過分子生物學方法檢測等確定外源基因的高效轉化。本專利技術采用雜交鵝掌楸單細胞起源的體細胞胚胎發生體系， 有利于外源基因的導入，并降低了嵌合體的產生，具有很好的實用性。附圖說明圖1是雜交鵝掌楸的懸浮細胞系的顯微照片 圖2是雜交鵝掌楸體胚苗的顯微照片 圖3是PCR檢測轉化結果圖；圖中，泳道M為maker，泳道CK+為質粒pBI 121，泳道CK_為未經過轉化的馬褂木植株，泳道H2O為水，泳道1，2，3，4，5，6，7，8，9為隨機選取的⑶S細胞學檢測為陽性的馬褂木轉基因植株； 圖4是RT-PCR檢測轉化結果圖；圖中，泳道M為maker，泳道CK+為質粒pBI 121，泳道CK_為未經過轉化的馬褂木植株，泳道1，2，3，4，5為隨機選取的PCR檢測及⑶S細胞學檢測顯示陽性的植株。具體實施例方式下面結合具體實施例對本專利技術作進一步的說明。以下實施例中，所使用到的培養基配方如下，未特別列出的，為常規培養基。MS 基本培養基配方:1650mg/L NH4NO3,1900mg/L KNO3,170mg/L KH2PO4, 370mg/L MgSO4.7H20,440mg/L CaCl2, 27.8mg/L FeSO4.7H20, 37.3mg/L Na2EDTA, 22.3mg/LMnSO4.H20,8.6mg/L ZnSO4.7H20,6.2mg/L H3BO3,0.83mg/L KI,0.本文檔來自技高網...
【技術保護點】
一種雜交鵝掌楸高效遺傳轉化方法，其特征在于，包括以下步驟：（1）雜交鵝掌楸轉化受體的建立：取繼代2周的雜交鵝掌楸愈傷組織細胞，接入含有雜交鵝掌楸M13液體培養基的三角瓶中，23℃，95r/min的恒溫搖床振蕩培養；每7天繼代一次，繼代3次后建立出懸浮細胞系，即為雜交鵝掌楸轉化受體；（2）農桿菌制備：先活化EHA105單菌落，在含有卡那霉素50mg/L、鏈霉素30mg/L的LB液體培養基中，28℃，280r/min振蕩培養至OD600為0.6?0.8，4℃離心收集菌體，用雜交鵝掌楸M13液體繼代培養基重懸菌體，將菌液濃度稀釋至0.5左右；（3）侵染：取3ml菌液加到雜交鵝掌楸轉化受體中，并加入乙酰丁香酮100μmol/L；靜置1?3min后，置于23℃、95r/min的恒溫搖床中，繼續振蕩培養16~40h；（4）脫菌培養：將雜交鵝掌楸懸浮細胞經400目及150目的篩子過篩，用Z36雜交鵝掌楸單細胞培養基將400目的篩子上的單細胞懸浮，置于23℃、95r/min的恒溫搖床，振蕩培養36h后，再用400目的篩子過篩一次，并用加有頭孢霉素500mg/L的Z36雜交鵝掌楸單細胞培養基將400目篩子上的單細胞收集；并將單細胞以2mL每皿的濃度鋪平板，培養基加頭孢霉素500mg/L，約21天繼代一次；繼代一次后，可以觀察到子葉胚；（5）篩選培養：待子葉胚成熟，長到2cm左右，將其挑出，轉到MS基本培養基上生長，其中加有頭孢霉素200mg/L，卡那霉素50mg/L。...
【技術特征摘要】
1.一種雜交鵝掌楸高效遺傳轉化方法，其特征在于，包括以下步驟: (1)雜交鵝掌楸轉化受體的建立:取繼代2周的雜交鵝掌楸愈傷組織細胞，接入含有雜交鵝掌楸M13液體培養基的三角瓶中，23°C，95r/min的恒溫搖床振蕩培養；每7天繼代一次，繼代3次后建立出懸浮細胞系，即為雜交鵝掌楸轉化受體； (2)農桿菌制備:先活化EHA105單菌落，在含有卡那霉素50mg/L、鏈霉素30mg/L的LB液體培養基中，28°C，280r/min振蕩培養至0D_為0.6-0.8，4°C離心收集菌體，用雜交鵝掌楸M13液體繼代培養基重懸菌體，將菌液濃度稀釋至0.5左右； (3)侵染:取3ml菌液加到雜交鵝掌楸轉化受體中，并加入乙酰丁香酮lOOymol/L； 靜置l_3min后，置于23°C、95r/min的恒溫搖床中，繼續振蕩培養16 40h ； (4)脫菌培養:將雜交鵝掌楸懸浮細胞經400目及150目的篩子過篩，用Z36雜交鵝掌楸單細胞培養基將400目 的篩子上的單細胞懸浮，置于23°C、95r/min的恒溫搖床，振蕩培養36h后，再用400目的篩子過篩一次，并用加有頭孢霉素500mg/L的Z36雜交鵝掌楸單細胞培養基將400目篩子上的單細胞收集；并將單細胞以2mL每皿的濃度鋪平板，培養基加頭孢霉素500mg/L，約21天繼代一次；繼代一次后，可以觀察到子葉胚； (5)篩選培養:待子葉胚成熟，長到2cm左右，將其挑出，轉到MS基本培養基上生長，其中加有頭孢霉素200mg/L，卡那霉素50mg/L。2.根據權利要求1所述的雜交鵝掌楸高效遺傳轉化方法，其特征在于:步驟(I)中，取繼代2周的雜交鵝掌楸愈傷組織細胞5mL，將其接種到250mL的三角瓶中，并在瓶壁輕輕敲...
【專利技術屬性】
技術研發人員：陳金慧，王丹，施季森，成鐵龍，王鵬凱，
申請(專利權)人：南京林業大學，
類型：發明
國別省市：
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