一種基于柑橘全爪螨幾丁質(zhì)基因的RNA干擾載體制備方法技術(shù)

本發(fā)明專利技術(shù)公開了一種基于柑橘全爪螨幾丁質(zhì)基因的RNA干擾載體制備及應(yīng)用方法，通過BLAST搜索，從柑橘全爪螨轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫鑒定出13條幾丁質(zhì)酶基因，從中挑選Unigene7021進(jìn)行真實性檢測，然后在NCBI上搜索比對保守序列，合成對應(yīng)的dsRNA，將正、反向幾丁質(zhì)酶目的片段先后插入到載體內(nèi)含子兩端，從而構(gòu)成反向互補(bǔ)發(fā)卡結(jié)構(gòu)的RNAi載體“PFGC-7021P1F1/7021P2F2”，將構(gòu)建的載體轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌感受態(tài)中，進(jìn)而將農(nóng)桿菌侵染植株獲得轉(zhuǎn)基因柑橘材料。

【技術(shù)實現(xiàn)步驟摘要】

本專利技術(shù)屬于RNA干擾載體制備
，尤其涉及一種基于柑橘全爪螨幾丁質(zhì)基因的RNA干擾載體制備及應(yīng)用。
技術(shù)介紹
柑橘全爪螨是一種世界性害螨，對柑橘產(chǎn)量和品質(zhì)影響較大，目前化學(xué)防治仍是控制柑橘全爪螨的重要措施。化學(xué)農(nóng)藥施用不當(dāng)，不僅影響果品安全，同時還會導(dǎo)致嚴(yán)重的抗性藥。基于RNA干擾技術(shù)獲得抗昆蟲的轉(zhuǎn)基因材料已在水稻、蔬菜和棉花等作物上取得成功。昆蟲幾丁質(zhì)酶參與昆蟲(螨類)蛻皮、圍食膜降解和防御等重要生命活動。通過柑橘全爪螨幾丁質(zhì)酶基因構(gòu)建RNA干擾載體，進(jìn)而獲得轉(zhuǎn)基因柑橘材料對柑橘全爪螨進(jìn)行控制具有廣闊的應(yīng)用前景。
技術(shù)實現(xiàn)思路
本專利技術(shù)實施例的目的在于提供一種基于柑橘全爪螨幾丁質(zhì)基因的RNA干擾載體制備方法，旨在解決利用RNA干擾技術(shù)進(jìn)行育種的問題。本專利技術(shù)實施例是這樣實現(xiàn)的，一種柑橘全爪螨幾丁質(zhì)基因的應(yīng)用方法，通過BLAST搜索，從柑橘全爪螨轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫鑒定出13條幾丁質(zhì)酶基因，從中挑選Unigene7021進(jìn)行真實性檢測，然后在NCBI上搜索比對保守序列，合成對應(yīng)的dsRNA，將正、反向幾丁質(zhì)酶目的片段先后插入到載體內(nèi)含子兩端，從而構(gòu)成反向互補(bǔ)發(fā)卡結(jié)構(gòu)的RNAi載體“PFGC-7021P1F1/7021P2F2”，將構(gòu)建的載體轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌感受態(tài)中，進(jìn)而將農(nóng)桿菌侵染植株獲得轉(zhuǎn)基因相橘材料。 進(jìn)一步，通過柑橘全爪螨轉(zhuǎn)錄組搜索，獲得幾丁質(zhì)酶基因Unigene7021,對該基因序列進(jìn)行真實性檢測后，在NCBI上比對找出保守序列設(shè)計構(gòu)建dsRNA。進(jìn)一步，將正向目標(biāo)基因7021P1F1質(zhì)粒雙酶切，同時將載體PFGC5941質(zhì)粒用相同兩個酶酶切；用T4連接酶將其連接，然后將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌，隨機(jī)挑選單克隆用通用引物Pl，F(xiàn)lPCR檢測篩選正確的菌株，提取質(zhì)粒，然后酶切驗證得到“PFGC-7021P1F1”;將得到的“PFGC-7021P1F1”質(zhì)粒雙酶切，同時相同酶切反向目標(biāo)基因7021P2F2，T4連接酶連接，轉(zhuǎn)入大腸桿菌隨機(jī)挑選單克隆，酶切驗證，得到“PFGC5941-正向片段7021P1F1/反向片段 7021P2F2”。進(jìn)一步，將獲得的農(nóng)桿菌LBA4404菌株侵染外植體，并進(jìn)行分子檢測將準(zhǔn)備好的外植體分別置于盛有重組質(zhì)粒的農(nóng)桿菌的培養(yǎng)血中，侵染。將上胚軸水平放置于共培養(yǎng)基上，培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，取出莖段漂洗，然后水平放于篩選培養(yǎng)基上培養(yǎng)，誘導(dǎo)芽生長直至可以進(jìn)行嫁接；提取轉(zhuǎn)基因柑橘苗和其陰性對照植株的基因組DNA，并采用基于GUS基因序列的特異引進(jìn)行擴(kuò)增、電泳檢測。本專利技術(shù)應(yīng)用幾丁質(zhì)酶在昆蟲發(fā)育過程中的調(diào)控作用，通過柑橘全爪螨幾丁質(zhì)酶基因構(gòu)建RNA干擾載體，最終獲得含特異dsRNA的轉(zhuǎn)基因柑橘材料。該轉(zhuǎn)基因材料在生產(chǎn)上的推廣應(yīng)用必將對柑橘全爪螨的控制發(fā)揮重要作用，同時減少化學(xué)農(nóng)藥使用量，因而具有極其廣闊的市場前景。附圖說明圖1是本專利技術(shù)實施例提供的基于柑橘全爪螨幾丁質(zhì)基因的RNA干擾載體制備方法的實現(xiàn)流程圖。具體實施例方式為了使本專利技術(shù)的目的、技術(shù)方案及優(yōu)點更加清楚明白，以下結(jié)合附圖及實施例，對本專利技術(shù)進(jìn)行進(jìn)一步詳細(xì)說明。應(yīng)當(dāng)理解，此處所描述的具體實施例僅僅用以解釋本專利技術(shù)，并不用于限定本專利技術(shù)。圖1示出了本專利技術(shù)實施例提供的基于柑橘全爪螨幾丁質(zhì)基因的RNA干擾載體制備方法的實現(xiàn)流程。一種基于柑橘全爪螨幾丁質(zhì)基因的RNA干擾載體制備方法，通過BLAST搜索，從柑橘全爪螨轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫鑒定出13條幾丁質(zhì) 酶基因，從中挑選Unigene7021進(jìn)行真實性檢測，然后在NCBI上搜索比對保守序列，合成對應(yīng)的dsRNA，將正、反向幾丁質(zhì)酶目的片段先后插入到載體內(nèi)含子兩端，從而構(gòu)成反向互補(bǔ)發(fā)卡結(jié)構(gòu)的RNAi載體“PFGC-7021P1F1/7021P2F2”，將構(gòu)建的載體轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌感受態(tài)中，進(jìn)而將農(nóng)桿菌侵染植株獲得轉(zhuǎn)基因相橘材料。在本專利技術(shù)實施例中，通過柑橘全爪螨轉(zhuǎn)錄組搜索，獲得幾丁質(zhì)酶基因Unigene7021，對該基因序列進(jìn)行真實性檢測后，在NCBI上比對找出保守序列設(shè)計構(gòu)建dsRNAο在本專利技術(shù)實施例中，將正向目標(biāo)基因7021P1F1質(zhì)粒雙酶切，同時將載體PFGC5941質(zhì)粒用相同兩個酶酶切；用T4連接酶將其連接，然后將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌，隨機(jī)挑選單克隆用通用引物Pl，F(xiàn)lPCR檢測篩選正確的菌株，提取質(zhì)粒，然后酶切驗證得到“PFGC-7021P1F1 ” ；將得到的“PFGC-7021P1F1 ”質(zhì)粒雙酶切，同時相同酶切反向目標(biāo)基因7021P2F2，T4連接酶連接，轉(zhuǎn)入大腸桿菌隨機(jī)挑選單克隆，酶切驗證，得到“PFGC5941-正向片段 7021P1F1/ 反向片段 7021P2F2”。在本專利技術(shù)實施例中，將獲得的農(nóng)桿菌LBA4404菌株侵染外植體，并進(jìn)行分子檢測將準(zhǔn)備好的外植體分別置于盛有重組質(zhì)粒的農(nóng)桿菌的培養(yǎng)血中，侵染。將上胚軸水平放置于共培養(yǎng)基上，培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，取出莖段漂洗，然后水平放于篩選培養(yǎng)基上培養(yǎng)，誘導(dǎo)芽生長直至可以進(jìn)行嫁接；提取轉(zhuǎn)基因柑橘苗和其陰性對照植株的基因組DNA，并采用基于GUS基因序列的特異引進(jìn)行擴(kuò)增、電泳檢測。以上所述僅為本專利技術(shù)的較佳實施例而已，并不用以限制本專利技術(shù)，凡在本專利技術(shù)的精神和原則之內(nèi)所作的任何修改、等同替換和改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本專利技術(shù)的保護(hù)范圍之內(nèi)。本文檔來自技高網(wǎng)...

【技術(shù)保護(hù)點】
一種一種基于柑橘全爪螨幾丁質(zhì)基因的RNA干擾載體制備方法，其特征在于，通過BLAST搜索，從柑橘全爪螨轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫鑒定出13條幾丁質(zhì)酶基因，從中挑選Unigene7021進(jìn)行真實性檢測，然后在NCBI上搜索比對保守序列，合成對應(yīng)的dsRNA，將正、反向幾丁質(zhì)酶目的片段先后插入到載體內(nèi)含子兩端，從而構(gòu)成反向互補(bǔ)發(fā)卡結(jié)構(gòu)的RNAi載體“PFGC?7021P1F1/7021P2F2”，將構(gòu)建的載體轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌感受態(tài)中，進(jìn)而將農(nóng)桿菌侵染植株獲得轉(zhuǎn)基因柑橘材料。

【技術(shù)特征摘要】
1.一種一種基于柑橘全爪螨幾丁質(zhì)基因的RNA干擾載體制備方法，其特征在于，通過BLAST搜索，從柑橘全爪螨轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫鑒定出13條幾丁質(zhì)酶基因，從中挑選Unigene7021進(jìn)行真實性檢測，然后在NCBI上搜索比對保守序列，合成對應(yīng)的dsRNA，將正、反向幾丁質(zhì)酶目的片段先后插入到載體內(nèi)含子兩端，從而構(gòu)成反向互補(bǔ)發(fā)卡結(jié)構(gòu)的RNAi載體“PFGC-7021P1F1/7021P2F2”，將構(gòu)建的載體轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌感受態(tài)中，進(jìn)而將農(nóng)桿菌侵染植株獲得轉(zhuǎn)基因相橘材料。2.如權(quán)利要求1所述的RNA干擾載體制備方法，其特征在于，通過柑橘全爪螨轉(zhuǎn)錄組搜索，獲得幾丁質(zhì)酶基因Unigene7021，對該基因序列進(jìn)行真實性檢測后，在NCBI上比對找出保守序列設(shè)計構(gòu)建dsRNA。3.如權(quán)利要求1所述的RNA干擾載體制備方法，其特征在于，將正向目標(biāo)基因7021P1F1質(zhì)粒雙酶切，同時將載體PFGC5941質(zhì)粒用相同兩...

【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：冉春，張云飛，劉浩強(qiáng)，陳飛，李鴻筠，李俊麗，李曉姣，岳建書，
申請(專利權(quán))人：冉春，
類型：發(fā)明
國別省市：