本發明專利技術公開了一種基于RNA干擾的抗柑橘全爪螨育種方法，從柑橘全爪螨轉錄組數據庫鑒定出幾丁質酶基因Unigene10731，進行真實性檢測后應用RACE技術獲得全長序列，然后在NCBI上搜索比對保守序列，合成對應的dsRNA，將正、反向幾丁質酶目的片段先后插入到載體內含子兩端，從而構成反向互補發卡結構的RNAi載體“PFGC-10731P1F1/10731P2F2”，將此RNAi載體轉載于農桿菌中對柑橘苗木進行侵染，進而對轉基因柑橘苗木進行抗螨性評價，獲得抗柑橘全爪螨的轉基因材料。
【技術實現步驟摘要】
本專利技術屬于育種
，尤其涉及一種基于RNA干擾的抗柑橘全爪螨育種方法。
技術介紹
柑橘全爪螨是一種世界性柑橘害螨，對柑橘產量和品質影響較大，目前化學防治仍是控制柑橘全爪螨的重要措施。化學農藥施用不當，不僅影響果品安全，同時還會導致嚴重的抗性藥?；赗NA干擾技術獲得抗昆蟲的轉基因材料已在水稻、蔬菜和棉花等作物上取得成功。昆蟲幾丁質酶參與昆蟲(螨類)蛻皮、圍食膜降解和防御等重要生命活動，通過柑橘全爪螨幾丁質酶基因構建RNA干擾載體，進而獲得轉基因柑橘材料對柑橘全爪螨進行控制具有廣闊的市場前景。
技術實現思路
本專利技術實施例的目的在于提供一種基于RNA干擾的抗柑橘全爪螨育種方法，旨在解決利用RNA干擾技術進行育種的問題。`本專利技術實施例是這樣實現的，一種基于RNA干擾的抗柑橘全爪螨育種方法，該育種方法從柑橘全爪螨轉錄組數據庫鑒定出幾丁質酶基因Unigenel0731，進行真實性檢測后應用RACE技術獲得全長序列，然后在NCBI上搜索比對保守序列，合成對應的dsRNA，將正、反向幾丁質酶目的片段先后插入到載體內含子兩端，從而構成反向互補發卡結構的RNAi載體“PFGC-10731P1F1/10731P2F2”，將此RNAi載體轉載于農桿菌中對柑橘苗木進行侵染，進而對轉基因柑橘苗木進行抗螨性評價，獲得抗柑橘全爪螨的轉基因材料。進一步，通過柑橘全爪螨轉錄組搜索，獲得幾丁質酶基因Unigenel0731,然后RACE擴增全長基因，NCBI上比對找出保守序列設計構建dsRNA。進一步，將正向目標基因10731P1F1質粒雙酶切，同時將載體PFGC5941質粒用相同兩個酶酶切；用T4連接酶將其連接，然后將連接產物轉化大腸桿菌，隨機挑選單克隆用通用引物P1，F1PCR檢測篩選正確的菌株，提取質粒，然后酶切驗證得到“PFGC-10731P1F1”；將得到的“PFGC-10731P1F1”質粒雙酶切，同時相同酶切反向目標基因10731P2F2，T4連接酶連接，轉入大腸桿菌隨機挑選單克隆，酶切驗證，得到“PFGC5941-正向片段10731P1F1/反向片段10731P2F2”。進一步，將獲得的農桿菌LBA4404菌株侵染外植體，并進行抗柑橘全爪螨評價將準備好的外植體分別置于盛有重組質粒的農桿菌的培養血中，侵染。將上胚軸水平放置于共培養基上，培養箱中培養，取出莖段漂洗，然后水平放于篩選培養基上培養，誘導芽生長直至可以進行嫁接。提取轉基因柑橘苗和其陰性對照植株的基因組DNA，并采用基于GUS基因序列的特異引進行擴增、電泳檢測；最終對轉基因柑橘苗進行抗柑橘全爪螨評價，選取抗性高的材料備用。本專利技術應用幾丁質酶在昆蟲發育過程中的調控作用，通過柑橘全爪螨幾丁質酶基因構建RNA干擾載體，最終獲得含特異dsRNA的轉基因柑橘材料。該轉基因材料在生產上的推廣應用必將對柑橘全爪螨的控制發揮重要作用，同時減少化學農藥使用量，因而具有極其廣闊的市場前景。附圖說明圖1是本專利技術實施例提供的基于RNA干擾的抗柑橘全爪螨育種方法的實現流程圖。具體實施例方式為了使本專利技術的目的、技術方案及優點更加清楚明白，以下結合附圖及實施例，對本專利技術進行進一步詳細說明。應當理解，此處所描述的具體實施例僅僅用以解釋本專利技術，并不用于限定本專利技術。圖1示出了本專利技術實施例提供的基于RNA干擾的抗柑橘全爪螨育種方法的實現流程。 該育種方法從柑橘全爪螨轉錄組數據庫鑒定出幾丁質酶基因Unigenel0731，進行真實性檢測后應用RACE技術獲得全長序列，然后在NCBI上搜索比對保守序列，合成對應的dsRNA，將正、反向幾丁質酶目的片段先后插入到載體內含子兩端，從而構成反向互補發卡結構的RNAi載體“PFGC-10731P1F1/10731P2F2”，將此RNAi載體轉載于農桿菌中對柑橘苗木進行侵染，進而對轉基因柑橘苗木進行抗螨性評價，獲得抗柑橘全爪螨的轉基因材料。進一步，通過柑橘全爪螨轉錄組搜索，獲得幾丁質酶基因Unigenel0731，然后RACE擴增全長基因，NCBI上比對找出保守序列設計構建dsRNA。進一步，將正向目標基因10731P1F1質粒雙酶切，同時將載體PFGC5941質粒用相同兩個酶酶切；用T4連接酶將其連接，然后將連接產物轉化大腸桿菌，隨機挑選單克隆用通用引物P1，F1PCR檢測篩選正確的菌株，提取質粒，然后酶切驗證得到“PFGC-10731P1F1”；將得到的“PFGC-10731P1F1”質粒雙酶切，同時相同酶切反向目標基因10731P2F2，T4連接酶連接，轉入大腸桿菌隨機挑選單克隆，酶切驗證，得到“PFGC5941-正向片段10731P1F1/反向片段10731P2F2”。進一步，將獲得的農桿菌LBA4404菌株侵染外植體，并進行抗柑橘全爪螨評價將準備好的外植體分別置于盛有重組質粒的農桿菌的培養血中，侵染。將上胚軸水平放置于共培養基上，培養箱中培養，取出莖段漂洗，然后水平放于篩選培養基上培養，誘導芽生長直至可以進行嫁接。提取轉基因柑橘苗和其陰性對照植株的基因組DNA，并采用基于GUS基因序列的特異引進行擴增、電泳檢測；最終對轉基因柑橘苗進行抗柑橘全爪螨評價，選取抗性高的材料備用。以上所述僅為本專利技術的較佳實施例而已，并不用以限制本專利技術，凡在本專利技術的精神和原則之內所作的任何修改、等同替換和改進等，均應包含在本專利技術的保護范圍之內。基因序列表Unigenel0731ACGACGGCAGTGATTCGAGCTCGGTACCCGGGGATCCTCTAGAGATTCTAATACGACTCACTATAGGGCAAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTACATGGGAAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTACATGGGGATGTTAGTTAATGGTTAGTTGTTGACGATTCACAATTAACCTTAAGTGATACTTGACTGTTTAAATTGTGCGAAATTGTAACTTTAACATGrrACCCTTTTCGAGTTTAATTGTTACTTTCACTCTTTTATTTGGAACAATTAACTGTCAGAATTGTCCATCAAGTGAGGGATATTTTCAAGATCCTTCGAACTGTTCAAAATTTTTCTACTGTTCGAGCGGAAAAATTGTTCACAAATACGAATGCGGTTCTAATTCCGTTTTTAATCCTGACCTGAAAATCTGCGATTGGAAAGAAAACACCAAATGTGAATCTGATTCATCTCCATCATCGACCACAACAACAGCGGCTAAACCTTTGGTCGGAGAAAACGAAATTCCCGATAATTCAATTGAGACTTCAAGTTCTAACCCGCCGACTTCATCATCTACCTTTGCCCCGACAACCTCGTCAACCTCACCCTCGA.CTTCAGCCCCAACTTCCACTTCCACTTCAACTTCAACCACAACTCAAACTTCAAA'r'GTAATTGAl'GTTGAAACTGAGAAl'CCATATGAATGGCATCCACCCATTGGACCCACAACGACCGCCGAACCTGATCCAATGGAAGGTTTTAATGACGATTAT本文檔來自技高網...
【技術保護點】
一種基于RNA干擾的抗柑橘全爪螨育種方法，其特征在于，該育種方法從柑橘全爪螨轉錄組數據庫鑒定出幾丁質酶基因Unigene10731，進行真實性檢測后應用RACE技術獲得全長序列，然后在NCBI上搜索比對保守序列，合成對應的dsRNA，將正、反向幾丁質酶目的片段先后插入到載體內含子兩端，從而構成反向互補發卡結構的RNAi載體“PFGC?10731P1F1/10731P2F2”，將此RNAi載體轉載于農桿菌中對柑橘苗木進行侵染，進而對轉基因柑橘苗木進行抗螨性評價，獲得抗柑橘全爪螨的轉基因材料。
【技術特征摘要】
1.一種基于RNA干擾的抗柑橘全爪螨育種方法，其特征在于，該育種方法從柑橘全爪螨轉錄組數據庫鑒定出幾丁質酶基因Unigenel0731，進行真實性檢測后應用RACE技術獲得全長序列，然后在NCBI上搜索比對保守序列，合成對應的dsRNA，將正、反向幾丁質酶目的片段先后插入到載體內含子兩端，從而構成反向互補發卡結構的RNAi載體“PFGC-10731P1F1/10731P2F2”，將此RNAi載體轉載于農桿菌中對柑橘苗木進行侵染，進而對轉基因柑橘苗木進行抗螨性評價，獲得抗柑橘全爪螨的轉基因材料。2.如權利要求1所述的抗柑橘全爪螨育種方法，其特征在于，I)、通過柑橘全爪螨轉錄組搜索，獲得幾丁質酶基因Unigenel0731，然后RACE擴增全長基因，NCBI上比對找出保守序列設計構建dsRNA。3.如權利要求1所述的抗柑橘全爪螨育種方法，其特征在于，將正向目標基因10731P1F1質粒雙酶切，同時將載體PFGC5941質粒用相同兩個酶酶切；用T4連接...
【專利技術屬性】
技術研發人員：冉春，張云飛，劉浩強，何永睿，陳善春，陳飛，李鴻筠，李俊麗，
申請(專利權)人：冉春，
類型：發明
國別省市：
還沒有人留言評論。發表了對其他瀏覽者有用的留言會獲得科技券。