一種大鱗鲃魚腎細胞體內培養制備染色體的方法技術

一種大鱗鲃魚腎細胞體內培養制備染色體的方法，涉及魚類染色體的制備方法。本發明專利技術是要解決大鱗鲃魚染色體的制備方法的技術問題。本發明專利技術的方法如下：一、活體注射：兩次活體腹腔注射植物血球凝集素(PHA)后，注射秋水仙素；二、取樣：取頭腎于NaCl生理鹽水中洗滌、收集細胞；三、用檸檬酸鈉和KCl混合溶液低滲；四、卡諾氏固定液冷凍固定；五、冷滴片法滴片；六、吉姆薩(Giemsa)染色液染色，即得大鱗鲃魚染色體。本發明專利技術操作簡便，結果穩定，可獲得數目完整、分散良好、形態清晰的大鱗鲃魚染色體中期分裂相標本。本發明專利技術應用于魚類染色體的制備領域。

【技術實現步驟摘要】

本專利技術涉及魚類染色體的制備方法。
技術介紹
大鱗魚巴(Barbuscapito)屬鯉科(Cyprinidae)、魚巴亞科(Barbinae)、魚巴屬(Barbodes)，原產于烏茲別克斯坦的咸海。它具有食性廣、生長速度快、肉質鮮美、耐鹽堿、適應性強等優良性狀，其最大個體長70cm、重12kg，是當地重要的大型經濟魚類(尼科里斯基著，繆學祖，林福申，田明誠譯.分門魚類學[M].北京:高等教育出版社，1958:186-189.)。2003年黑龍江水產研究所將該魚引入我國，旨在增加內陸鹽堿水域魚類養殖品種，以促進鹽堿水域的開發和利用。染色體是遺傳物質的主要載體，染色體數與染色體核型是生物細胞遺傳學研究的主要內容之一，對認識和探索生物的染色體演化過程、分類系統及進化關系具有重要意義，還可為魚類遺傳育種提供細胞遺傳學依據。染色體制備是細胞遺傳學研究中的一項基本的技術，快速、簡便地獲得形態好、分裂指數高的染色體結果是進行核型分析的前提和基礎。目前，魚類染色體制備方法主要分為直接法、體內培養法和細胞培養法三大類，雖然制備原理基本相同，但由于不同魚類組織結構的不同及處理方法的差異，得到的細胞分裂中期相的數量和質量也不盡相同。因此，每種魚類成熟的染色體制備條件還是需要不斷摸索和反復試驗才能建立。目前，涉及大鱗鈀染色體的體內培養制備方法還未見報道。
技術實現思路
本專利技術提供了一種大鱗鈀魚腎細胞體內培養制備染色體的方法。本專利技術的一種大鱗鈀魚腎細胞體內培養制備染色體的方法是按以下步驟進行的:一、活體注射:用5 IOppm苯氧乙醇將大鱗鈀魚麻醉后稱重，第一次活體腹腔注射植物血球凝集素(PHA)，劑量與大鱗鈀魚體重的比為7 12 ii g: lg，16 20h后第二次活體腹腔注射植物血球凝集素(PHA)，劑量與大鱗鈀魚體重的比為5 10 ii g: lg，作用4 6h后注射質量濃度為0.1% 0.2%的秋水仙素，劑量與大鱗鈀魚體重的比為5 IOug: lg，反應時間為2 4h ;二、取樣:將步驟一處理的大鱗鈀魚剪鰓，水中放血10 15min，然后取出頭腎于質量濃度為0.7% 0.9%的NaCl生理鹽水中洗滌，用手術剪剪碎至生理鹽水變渾濁為止，靜置3 5min后用吸管收集上層細胞懸液于離心管中，在轉速為1000 1500r/min的條件下離心5 IOmin,棄上清,收集細胞；三、低滲:向步驟二收集的細胞中加入低滲液，用吸管吹打至細胞均勻分散后，室溫反應40 60min ;其中低滲液由質量濃度為0.1 % 0.5 %的KCl溶液和質量濃度為0.1% 0.5%的檸檬酸鈉溶液按體積比為1:1 2混合而成；四、固定:將步驟三低滲的細胞在轉速為1000 2000r/min的條件下離心5 IOmin,留0.3 0.5mL的上清液吹打成細胞懸液后，加入卡諾氏固定液固定20 30min ；五、重復步驟四的操作I 2次后，在1000 1500r/min的轉速下離心5 lOmin，棄上清液，沉淀物用卡諾氏固定液吹打成細胞懸液后置于-18 -20°C下冷凍過夜；六、冷滴片:把步驟五冷凍的細胞懸液離心后棄上清液，加入2 3mL的卡諾氏固定液混合均勻，取浸泡在冰水混合液中預冷的干凈載玻片，分散滴上2 3滴細胞懸液，立即將載玻片在酒精燈火焰上方過3 5次，使染色體分散和展開，然后于室溫下干燥；七、染色:將步驟六干燥的染色體載玻片用體積分數為10% 15%的吉姆薩(Giemsa)染色液染色30 50min，自來水沖洗，自然干燥后完成染色體標本制備，即得到大鱗魚巴魚染色體。本專利技術包括以下有益效果:1、本專利技術采用兩次注射植物血球凝集素(PHA)，第一次劑量與大鱗鈀魚體重的比為7 12iig: lg，第二次劑量與大鱗鈀魚體重的比為5 IOii g: lg，使魚體細胞增殖效果較好；2、本專利技術的秋水仙素的注射劑量與大鱗鈀魚體重的比為5 IOii g: lg，反應時間為2 4h，可較好的將細胞分裂停留在中期，獲得形態較好、圖像清晰的染色體中期分裂相；3、本專利技術在處理頭腎組織時采用質量濃度為0.7%的NaCl生理鹽水，接近腎細胞的滲透壓，避免細胞受外液滲透壓影響破碎；4、本專利技術的低滲液成分為質量濃度為0.2%的KCl和質量濃度為0.2%的檸檬酸鈉混合溶液，KCl的優點是染色體輪廓清楚，可染色性強，檸檬酸鈉的優點是具有良好的pH調節及緩沖性能，兩者混合使用，在細胞低滲過程中能保持染色體周圍環境的穩定，利于染色體形態保持完整；5、本專利技術操作簡便，結果穩定，可獲得數目完整、分散良好、形態清晰的大鱗鈀魚染色體中期分裂相標本。附圖說明圖1為試驗一制備的大鱗鈀魚染色體中期分裂相。具體實施例方式具體實施方式一:本實施方式的一種大鱗鈀魚腎細胞體內培養制備染色體的方法是按以下步驟進行的:一、活體注射:用5 IOppm苯氧乙醇將大鱗把魚麻醉后稱重,第一次活體腹腔注射植物血球凝集素(PHA)，劑量與大鱗鈀魚體重的比為7 12 ii g: lg，16 20h后第二次活體腹腔注射植物血球凝集素(PHA)，劑量與大鱗鈀魚體重的比為5 10 ii g: lg，作用4 6h后注射質量濃度為0.1 % 0.2%的秋水仙素，劑量與大鱗鈀魚體重的比為5 IOug: lg，反應時間為2 4h;二、取樣:將步驟一處理的大鱗鈀魚剪鰓，水中放血10 15min，然后取出頭腎于質量濃度為0.7% 0.9%的NaCl生理鹽水中洗滌，用手術剪剪碎至生理鹽水變渾濁為止，靜置3 5min后用吸管收集上層細胞懸液于離心管中，在轉速為1000 1500r/min的條件下離心5 IOmin,棄上清,收集細胞；三、低滲:向步驟二收集的細胞中加入低滲液，用吸管吹打至細胞均勻分散后，室溫反應40 60min ;其中低滲液由質量濃度為0.1 % 0.5 %的KCl溶液和質量濃度為0.1% 0.5%的檸檬酸鈉溶液按體積比為1:1 2混合而成；四、固定:將步驟三低滲的細胞在轉速為1000 2000r/min的條件下離心5 IOmin,留0.3 0.5mL的上清液吹打成細胞懸液后，加入卡諾氏固定液固定20 30min ；五、重復步驟四的操作I 2次后,在1000 1500r/min的轉速下離心5 IOmin,棄上清液，沉淀物用卡諾氏固定液吹打成細胞懸液后置于-18 -20°C下冷凍過夜；六、冷滴片:把步驟五冷凍的細胞懸液離心后棄上清液，加入2 3mL的卡諾氏固定液混合均勻，取浸泡在冰水混合液中預冷的干凈載玻片，分散滴上2 3滴細胞懸液，立即將載玻片在酒精燈火焰上方過3 5次，使染色體分散和展開，然后于室溫下干燥；七、染色:將步驟六干燥的染色體載玻片用體積分數為10% 15%的吉姆薩(Giemsa)染色液染色30 50min，自來水沖洗，自然干燥后完成染色體標本制備，即得到大鱗魚巴魚染色體。本實施方式包括以下有益效果:1、本實施方式采用兩次注射植物血球凝集素(PHA)，第一次劑量與大鱗鈀魚體重的比為7 12iig: lg，第二次劑量與大鱗鈀魚體重的比為5 IOiig: lg，使魚體細胞增殖效果較好；2、本實施方式的秋水仙素的注射劑量與大鱗鈀魚體重的比為5 IOii g: lg，反應時間為2 4h，可較好的將細胞分裂停留在中期，獲得形態較好本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種大鱗鲃魚腎細胞體內培養制備染色體的方法，其特征在于大鱗鲃魚腎細胞體內培養制備染色體的方法是按以下步驟進行的：一、活體注射：用5～10ppm苯氧乙醇將大鱗鲃魚麻醉后稱重，第一次活體腹腔注射植物血球凝集素(PHA)，劑量與體重的比為7～12μg∶1g，16～20h后第二次活體腹腔注射植物血球凝集素(PHA)，劑量與體重的比為5～10μg∶1g，作用4～6h后注射質量濃度為0.1％～0.2％的秋水仙素，劑量與體重的比為5～10μg∶1g，反應時間為2～4h；二、取樣：將步驟一處理的大鱗鲃魚剪鰓，水中放血10～15min，然后取出頭腎于質量濃度為0.7％～0.9％的NaCl生理鹽水中洗滌，用手術剪剪碎至生理鹽水變渾濁為止，靜置3～5min后用吸管收集上層細胞懸液于離心管中，在轉速為1000～1500r/min的條件下離心5～10min，棄上清，收集細胞；三、低滲：向步驟二收集的細胞中加入低滲液，用吸管吹打至細胞均勻分散后，室溫反應40～60min；其中低滲液由質量濃度為0.1％～0.5％的KCl溶液和質量濃度為0.1％～0.5％的檸檬酸鈉溶液按體積比為1∶1～2混合而成；四、固定：將步驟三低滲的細胞在轉速為1000～2000r/min的條件下離心5～10min，留0.3～0.5mL的上清液吹打成細胞懸液后，加入卡諾氏固定液固定20～30min；五、重復步驟四的操作1～2次后，在1000～1500r/min的轉速下離心5～10min，棄上清液，沉淀物用卡諾氏固定液吹打成細胞懸液后置于?18～?20℃下冷凍過夜；六、冷滴片：把步驟五冷凍的細胞懸液離心后棄上清液，加入2～3mL的卡諾氏固定液混合均勻，取浸泡在冰水混合液中預冷的干凈載玻片，分散滴上2～3滴細胞懸液，立即將載玻片在酒精燈火焰上方過3～5次，使染色體分散和展開，然后于室溫下干燥；七、染色：將步驟六干燥的染色體載玻片用體積分數為10％～15％的吉姆薩染色液染色30～50min，自來水沖洗，自然干燥后完成染色體標本制備，即得到大鱗鲃魚染色體。...

【技術特征摘要】
1.一種大鱗鈀魚腎細胞體內培養制備染色體的方法，其特征在于大鱗鈀魚腎細胞體內培養制備染色體的方法是按以下步驟進行的: 一、活體注射:用5 IOppm苯氧乙醇將大鱗鈀魚麻醉后稱重，第一次活體腹腔注射植物血球凝集素(PHA)，劑量與體重的比為7 12 ii g: Ig, 16 20h后第二次活體腹腔注射植物血球凝集素(PHA)，劑量與體重的比為5 IOiig: lg，作用4 6h后注射質量濃度為0.1% 0.2%的秋水仙素，劑量與體重的比為5 IOiig: lg，反應時間為2 4h ; 二、取樣:將步驟一處理的大鱗鈀魚剪鰓，水中放血10 15min，然后取出頭腎于質量濃度為0.7% 0.9%的NaCl生理鹽水中洗滌，用手術剪剪碎至生理鹽水變渾濁為止，靜置3 5min后用吸管收集上層細胞懸液于離心管中，在轉速為1000 1500r/min的條件下離心5 IOmin,棄上清,收集細胞； 三、低滲:向步驟二收集的細胞中加入低滲液，用吸管吹打至細胞均勻分散后，室溫反應40 60min ;其中低滲液由質量濃度為0.1% 0.5%的KCl溶液和質量濃度為0.1% 0.5%的檸檬酸鈉溶液按體積比為1:1 2混合而成； 四、固定:將步驟三低滲的細胞在轉速為1000 2000r/min的條件下離心5 lOmin，留0.3 0.5mL的上清液吹打成細胞懸液后，加入卡諾氏固定液固定20 30min ； 五、重復步驟四的操作I 2次后,在1000 1500r/min的轉速下離心5 IOmin...

【專利技術屬性】
技術研發人員：耿龍武，魯翠云，姜海峰，徐偉，
申請(專利權)人：中國水產科學研究院黑龍江水產研究所，
類型：發明
國別省市：