經修飾的蛋白及其制備和使用方法技術

提供了包含經修飾的蛋白、特別是具有改變的緩沖特性的經修飾的核酸-結合蛋白的方法，組合物，系統，裝置和試劑盒。例如，在一些實施方案中，描述了形成經修飾的蛋白的方法，所述經修飾的蛋白包括一個或多個氨基酸修飾以實現所需的pKa值。此外，本發明專利技術提供了在產生離子的反應，例如基于離子的核酸測序反應中，使用所述經修飾的蛋白的方法。

【技術實現步驟摘要】
【國外來華專利技術】經修飾的蛋白及其制備和使用方法根據35U.S.C.§119，本申請要求2010年2月26日遞交的美國臨時申請號61/308,863的權益，并且還要求2011年2月25日遞交的國際申請號PCT/US2011/026228的優先權，所述國際申請要求2010年2月26日遞交的美國臨時申請號61/308,863的權益，所有前述申請都在此以其全部通過引用而并入。背景直接檢測化學部分(例如離子)在簡化測定設計和花費方面有巨大的潛力。例如，在某些情況下，此類技術能夠減少或消除對于昂貴的標記試劑的需求；類似地，它們也能夠消除對于否則可能是必需的復雜檢測步驟的要求。此類技術的用處可通過其在DNA序列分析領域中的應用而顯示，對于DNA序列分析已描述了數種化學檢測方案。這些包括通過檢測延伸反應的物理化學副產物(例如焦磷酸，氫離子，電荷轉移，熱等)而檢測聚合酶延伸，如在例如下列中所描述的：Pourmand等人，Proc.Natl.Acad.Sci.，103:6466-6470(2006)；Purushothaman等人，IEEEISCAS，IV-169-172；Rothberg等人，美國專利公開號2009/0026082；Anderson等人，SensorsandActuatorsBChem.，129:79-86(2008)；Sakata等人，Angew.Chem.118:2283-2286(2006)；Esfandyapour等人，美國專利公開號2008/01666727；以及Sakurai等人，Anal.Chem.64:1996-1997(1992)。基于離子的反應(即涉及產生和檢測離子的反應)是廣泛進行的。使用直接離子檢測方法來監測此類反應的進展能夠簡化許多現存的生物學測定。例如，可通過檢測作為由聚合酶催化的核苷酸摻入的天然副產物而產生的氫離子而監測通過聚合酶進行的模板依賴性核酸合成。基于離子的測序(也稱作“基于pH的”核酸測序)利用的是直接檢測作為核苷酸摻入的副產物而產生的氫離子。在一個用于基于離子的測序的示例性系統中，在微孔中捕獲待測序的核酸，并在核苷酸摻入條件下使核苷酸(每次一個)浮過所述孔。聚合酶將適合的核苷酸摻入生長的鏈中，而被釋放的氫離子改變溶液中的pH，這是通過離子傳感器檢測的。這種技術不需要核苷酸的標記或者昂貴的光學組件，且允許快得多地完成測序運行。此類基于離子的核酸測序方法的實例包括IonTorrentPGMTM測序儀(LifeTechnologiesCorporation)。對于基于離子的反應(包括基于離子的核酸測序)，重要的是檢測盡可能多的所釋放的離子，從而實現盡可能高的信號，和相應地高的信噪比。鑒于離子從反應位點快速擴散以及其它反應組分和容器壁材料的緩沖效應，獲得足夠的信號可能是有挑戰性的。例如，基于離子的測序反應中的蛋白的緩沖效應能夠妨礙有效地檢測氫離子。因此需要用于減少蛋白反應組分的緩沖效應的方法和組合物，特別是用于在基于離子的核酸測序方法和系統中使用的。專利技術概述在一些實施方案中，本公開一般性地涉及包含經修飾的蛋白的組分、方法、系統、裝置和試劑盒，與未經修飾的其對應物相比，所述經修飾的蛋白具有減少的緩沖能力，還涉及用于制備和在廣泛的化學反應中使用所述經修飾的蛋白的方法。在一些實施方案中，本公開一般性地涉及包含經修飾的蛋白(例如，核酸結合蛋白)的方法、組分、系統和試劑盒，其用于基于離子的核酸序列確定。在一些實施方案中，本公開一般性地涉及組分、方法、系統、試劑盒和裝置，其用于在大規模的電子傳感器陣列(例如場效應晶體管(“FET”))上進行多個無標記的DNA測序反應。在一些實施方案中，本公開一般性地涉及包含一個或多個修飾的經修飾的蛋白，相對于相應的未經修飾的蛋白，所述修飾減少所述經修飾的蛋白的緩沖能力。任選地，所述一個或多個修飾在約pH4至約pH10的范圍內減少所述經修飾的蛋白的緩沖能力。在一些實施方案中，相對于相應的未經修飾的蛋白，所述一個或多個修飾在約pH7至約pH9的范圍內減少所述經修飾的蛋白的緩沖能力。在一些實施方案中，所述一個或多個修飾包括一個或多個氨基酸添加、置換、缺失、添加或化學修飾。在一些實施方案中，所述經修飾的蛋白包括一個或多個氨基酸置換，其不被包括在未經修飾的蛋白中。在一些實施方案中，本公開一般性地涉及分離的蛋白，其包含一個或多個氨基酸置換，相對于相應的野生型蛋白，所述氨基酸置換在約pH4至約pH10的范圍內降低所述蛋白的緩沖能力。在一些實施方案中，相對于相應的野生型蛋白，所述一個或多個氨基酸置換在約pH7至約pH9的范圍內降低所述蛋白的緩沖能力。在一些實施方案中，所述經修飾的蛋白是核酸結合蛋白。例如，所述蛋白可具有DNA-或RNA-結合活性。在各種實施方案中，所述蛋白選自DNA聚合酶，解旋酶，連接酶，核酸酶，單鏈DNA結合蛋白和聚合酶輔蛋白。在一些實施方案中，所述一個或多個氨基酸置換在約pH7至pH9的范圍內實質上降低所述蛋白的緩沖能力。在一些實施方案中，所述一個或多個氨基酸置換中的至少一個是保守性氨基酸置換。在其它實施方案中，所述至少一個保守性氨基酸置換選自組氨酸至精氨酸，谷氨酸至谷氨酰胺，天冬氨酸至天冬酰胺，賴氨酸至精氨酸，以及酪氨酸至苯丙氨酸。在一些實施方案中，所述蛋白是DNA聚合酶。在一些實施方案中，本公開一般性地涉及分離的DNA聚合酶，其包含一個或多個保守性氨基酸置換，與相應的野生型蛋白相比，所述氨基酸置換在約pH7至約pH9的范圍內在實質上降低其緩沖能力。在一些實施方案中，所述DNA聚合酶選自A家族DNA聚合酶；B家族DNA聚合酶；混合類型的聚合酶；未分類的DNA聚合酶以及RT家族聚合酶；及它們的變體和衍生物。在一些實施方案中，所述DNA聚合酶為選自下列的A家族DNA聚合酶：PolI型DNA聚合酶，例如大腸桿菌DNA聚合酶，大腸桿菌DNA聚合酶的Klenow片段，BstDNA聚合酶，TaqDNA聚合酶，鉑TaqDNA聚合酶系列，T7DNA聚合酶，和TthDNA聚合酶。在一些實施方案中，所述DNA聚合酶為BstDNA聚合酶。在其它實施方案中，所述DNA聚合酶為大腸桿菌DNA聚合酶。在一些實施方案中，所述DNA聚合酶為大腸桿菌DNA聚合酶的Klenow片段。在一些實施方案中，所述聚合酶為TaqDNA聚合酶。在一些實施方案中，所述聚合酶為T7DNA聚合酶。在其它實施方案中，所述DNA聚合酶為選自下列的B家族DNA聚合酶：Bst聚合酶，Tli聚合酶，Pfu聚合酶，Pfutubo聚合酶，Pyrobest聚合酶，Pwo聚合酶，KOD聚合酶，Sac聚合酶，Sso聚合酶，Poc聚合酶，Pab聚合酶，Mth聚合酶，Pho聚合酶，ES4聚合酶，VENT聚合酶，DEEPVENT聚合酶，TherminatorTM聚合酶，噬菌體Phi29聚合酶，以及噬菌體B103聚合酶。在一些實施方案中，所述聚合酶為KOD聚合酶。在一些實施方案中，所述聚合酶為TherminatorTM聚合酶。在一些實施方案中，所述聚合酶為噬菌體Phi29DNA聚合酶。在一些實施方案中，所述聚合酶為噬菌體B103聚合酶，這包括例如，美國專利公開號20110014612中所公開的變體，所述美國專利在此通過引用本文檔來自技高網...

【技術保護點】

【技術特征摘要】
【國外來華專利技術】2010.02.26 US 61/308,863;2011.02.25 US PCT/US2011/1.檢測核苷酸摻入的方法，包括:(a)使用經修飾的Bst聚合酶進行核苷酸摻入并產生一個或多個氫離子作為所述核苷酸摻入的副產物，其中所述經修飾的Bst聚合酶的氨基酸序列如SEQIDNO:2所示，其中所述修飾的Bst聚合酶相對于SEQIDNO:1所示的未經修飾的聚合酶具有降低的緩沖能力；和(b)檢測作為所述核苷酸摻入的副產物產生的所述一個或多個氫離子的存在，從而檢測所述核苷酸摻入。2.核酸測序的方法，所述方法包括:提供模板核酸，其與測序引物相雜交并且與經修飾的Bst聚合酶相結合,其中所述經修飾的Bst聚合酶的氨基酸序列如SEQIDNO:2所示...

【專利技術屬性】
技術研發人員：J·F·戴維森，W·欣茨，J·羅思伯格，R·惠特克，
申請(專利權)人：生命技術公司，
類型：
國別省市：