本發明專利技術公開了一種MTA1來源的抗腫瘤CTL表位肽，包括九肽，所述九肽的氨基酸序列為P109：Phe-Leu-Ser-Arg-Gln-Leu-Glu-Ser-Leu。本發明專利技術還包括上述肽在制備腫瘤治療性多肽疫苗中的應用。本發明專利技術的優點在于采用理論和實驗相結合的方法初步鑒定出腫瘤轉移相關抗原的表位肽。鑒定的九肽未見文獻報道，為研制基于抗原MTA1的腫瘤治療性多肽疫苗提供理論基礎，并為后續多價的抗原肽疫苗、長肽疫苗、多表位疫苗等的構建奠定基礎。
【技術實現步驟摘要】
本專利技術涉及肽，尤其是涉及MTAl來源的抗腫瘤CTL表位肽，本專利技術還涉及該肽在制備腫瘤治療性多肽疫苗中的應用。
技術介紹
轉移是一個涉及多種原因及其產物的復雜過程，包括腫瘤細胞從原發灶脫離，侵入淋巴管、血管及周圍組織，誘導血管形成，逃避宿主細胞抗腫瘤反應和在轉移部位生長。因此，了解腫瘤轉移所涉及的基因和基因產物是目前國內外研究的熱題。轉移相關蛋白I(MTAl)是1994年Toh等人在人的乳腺癌細胞中鑒定發現的。近年來的研究發現它在多種轉移性腫瘤中過表達，如乳腺癌、胃腸癌、食管癌、胰腺癌、胃癌、肝癌、非小細胞肺癌等，而在正常組織中低表達或不表達，并且其在腫瘤組織中的表達水平與其轉移或浸潤潛能有明顯的關系。這些研究結果表明MTAl是一個非常好的腫瘤相關抗原，是腫瘤診斷和治療的靶點。近年來大多數研究者將目光集中在MTA家族成員尤其是MTAl在多種人類腫瘤組織及腫瘤細胞中的表達情況、分子功能等方面，Li Kai等人在MTAl的抗前列腺癌血管生成方面取得了一定的研究成果。目前尚未見針對MTAl的HLA-1類限制性CTL表位肽的報道。隨著現代免疫學的發展，細胞毒性T淋巴細胞(Cytotoxic T lymphocyte, CTL)在腫瘤中發揮的重要作用越來越受到重視。如何有效激發CTL介導的特異性細胞免疫應答，發揮抗腫瘤效能，已經成為當今腫瘤治療性多肽疫苗研制領域的一個重要課題。既往研究發現，引起CTL免疫應答反應的，并非完整的腫瘤抗原分子，而是抗原來源的特異性CTL表位(Epitope)。抗原遞呈細胞攝取腫瘤抗原后,通過蛋白水解作用將其加工成為8 10個氨基酸長度的多肽片段，即CTL表位，進而與內質網腔中的主要組織相容性復合體I (MHC-1)類分子結合形成多肽-MHC復合物(P印tide-MHC complex, pMHC)，并最終將pMHC遞呈到細胞表面供CD8+T細胞表面的T細胞受體(T cell rec印tor，TCR)識別，從而活化CTL細胞，引發CTL免疫應答。
技術實現思路
本專利技術的目的在于提供一種對腫瘤細胞SW620具有一定殺傷力的MTAl來源的抗腫瘤CTL表位肽，同時本專利技術還提供了該肽在制備腫瘤治療性多肽疫苗中的應用。為實現上述目的，本專利技術可采取下述技術方案: 本專利技術所述的MTAl來源的抗腫瘤CTL表位肽，包括九肽，所述九肽的氨基酸序列為 P109:Phe-Leu-Ser-Arg-Gln-Leu-Glu-Ser-Leu 分子量為 1019.51。本專利技術還包括上述肽在制備高表達該抗原的腫瘤治療性多肽疫苗的應用。本專利技術的優點在于采用理論和實驗相結合的方法初步鑒定出腫瘤轉移相關抗原的表位肽。鑒定的九肽未見文獻報道，為研制基于抗原MTAl的腫瘤治療性多肽疫苗提供理論基礎，并為后續多價的抗原肽疫苗、長肽疫苗、多表位疫苗等的構建奠定基礎。附圖說明圖1-5是本專利技術表位肽的質譜分析圖。圖6是本專利技術表位肽誘導的特異性CTL對腫瘤細胞SW620 (MTAl-陽性，HLA-A2陽性)的殺傷作用。圖7-11是本專利技術表位肽誘導的特異性CTL分泌IFN-Y的能力。具體實施例方式本專利技術所述·的MTAl來源的抗腫瘤CTL表位肽，包括九肽，所述九肽的氨基酸序列為P22:Tyr-Leu-1Ie-Arg-Arg-1Ie-Glu-Glu-Leu或 P57:Ala-Leu-Ala-Asp-Lys-His-Ala-Thr-Leu或 P109:Phe-Leu-Ser-Arg-Gln-Leu-Glu-Ser_Leu或 P129:Thr-Leu-Leu-Asn-Glu-Thr-Glu-Ser_Leu或 P173:Tyr-Gln-Ala-Asp-1le-Thr-Asp-Leu_Leu0本專利技術主要采用理論與實踐相結合的方法，根據抗原的一級結構，采用免疫信息學手段，運用SYFPEITH1、BIMAS、NetCTL 1.2和IEDB數據庫對MTAl蛋白抗原的HLA_A*0201限制性CTL表位進行了預測分析。篩選獲得上述表位肽采用標準的Fmoc方案進行合成，經HPLC純化后，其純度大于90%，質譜分析并證實其分子量符合理論值。各肽質譜鑒定圖見圖1-5。上述表位肽的合成及制備:采用固相合成法。基本流程如下:首先將一個氨基被Fmoc基團保護的氨基酸連接在不溶性固相載體Wang樹脂上，然后脫掉氨基的保護基，第一個氨基酸即連接至固相載體上；其次將氨基被Fmoc基團保護的第二個氨基酸的羧基用縮合劑活化，活化后的氨基酸再與已接在固相載體的第一個氨基酸的氨基反應形成肽鍵，此時在固相載體上就生成了一個帶有保護基的二肽。重復上述的肽鍵形成反應，使肽鏈從C端向N端生長，直至達到所需要的肽鏈長度，最后切割得到目的肽。經HPLC純化后，其純度大于90%，質譜分析并證實其分子量符合理論值。(參見:①黃惟德、陳常慶著，多肽合成，科學出版社，1985年。②.N.休厄德、H.D.賈庫布克著，劉克良等譯，肽:化學與生物學，科學出版社，2005年) 本專利技術表位肽的人外周血單個核細胞(PBMCs)的分離與ELISP0T實驗檢測:抽取健康供者的外周血經密度梯度離心分離，獲得PBMCs，添加白細胞介素2(IL-2，P^rotech公司)和人β 2微球蛋白誘導分化CTL細胞，進一步在體外LDH和ELISP0T實驗進行驗證。方法如下: UPBMCs的分離與誘導:(1)以40ml PBSCPH 7.2)稀釋抗凝處理后的外周血40ml ；(2)離心管中加入4ml Lymphoprep分離液(Axis-Shield公司);(3)加8ml步驟(I)中稀釋后的外周血于4ml Lymphoprep分離液液面上；(4)20°C離心(2000rmpX20min); (5)離心后，分為四層，棄去最上層，用玻璃吸管吸取第二層即白膜層(富含PBMCs) ;(6)吸出的白膜層用PBS (pH 7.2)離心洗滌兩次；(7)用24孔板鋪板，細胞的濃度為I X 10 6/ml，每孔Iml ;(8)第二天每孔加入3 UgAP2微球蛋白和10 μ g表位肽，同時設立PBS組(以PBS替代表位肽)作為陰性對照組；(9)第三天每孔加入50u IL-2;每2 3天換液，于七天后進行第二輪荷肽(即每孔補加50u IL-2U0 UgAP2微球蛋白和10 μ g表位肽/PBS)，十四天后進行第三輪荷肽。第三輪荷肽后3天，得到效應細胞CTL，然后進行LDH實驗和ELISPOT實驗檢測待測肽的作用。2、LDH 檢測:使用 CytoTox 96 Non-Radioactive Cytotoxicity Assay (細胞毒性檢測試劑盒，Promega公司)進行LDH試驗檢測細胞毒活性。步驟如下(詳見試劑盒說明書): I)設立檢測板(100 μ I/孔) Cl)設立實驗組:以腫瘤細胞EC-9706 (ATCC公司)作為靶細胞(最優靶細胞數:5000)按不同效靶比10:1、20:1、40:1加入上述效應細胞CTL ； (2)設立效應細胞自發釋放組； (3)設立靶細胞自發釋放組； (4)設立靶細胞最大釋放組； (5)設立體積校正對照組； (6)設立背景對照組。2)細胞裂解及收獲上清 (1)37 °C、5%C02本文檔來自技高網...
【技術保護點】
一種MTA1來源的抗腫瘤CTL表位肽，包括九肽，其特征在于：所述九肽的氨基酸序列為?P109：Phe?Leu?Ser?Arg?Gln?Leu?Glu?Ser?Leu。
【技術特征摘要】
1.一種MTAl來源的抗腫瘤CTL表位肽，包括九肽，其特征在于:所述九肽的氨基酸序列為 P109:Phe-Leu-Ser-Arg-Gl...
【專利技術屬性】
技術研發人員：祁元明，吳亞紅，高艷鋒，陳飛，孫萌，韓艷林，時冉冉，陳艷平，
申請(專利權)人：鄭州大學，
類型：發明
國別省市：
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