一種篩選抗腸癌藥物的方法技術

本發(fā)明專利技術提供了一種以HIF-1α為靶點的抗腫瘤藥物的篩選方法，以高效表達HIF-1α基因的腸癌細胞為細胞對象，篩選基于抑制HIF-1α表達的抗腫瘤藥物，具有高效、快速、簡便、直觀的優(yōu)點，可用于高通量快速篩選以HIF-1α為靶點的抗腫瘤藥物。

【技術實現(xiàn)步驟摘要】

本專利技術涉及一種篩選藥物的方法，尤其涉及一種以HIF-1 α為靶點的抗腫瘤藥物的篩選方法。
技術介紹
缺氧誘導因子I (hypoxia inducible factor 1，HIF-1)是 HIFs 家族中最先被發(fā)現(xiàn)的成員，由對氧敏感的α亞基和穩(wěn)定表達的β亞基組成的異源二聚體，作為缺氧誘導的、連接在EPO基因低氧反應元件上的一個核因子，在腫瘤細胞增殖代謝、腫瘤血管發(fā)生、侵襲轉移和對藥物治療的反應中起著關鍵的調節(jié)作用。HIF-1 α是HIF-1的調節(jié)及活性亞基，可被缺氧誘導表達，在細胞漿分泌后轉移到細胞核內與HIF-1 β結合，激活下游靶基因，HIF-1的生物效應是主要由HIF-1a亞基介導實現(xiàn)。HIF-1 α基因位于人染色體14q21_q24區(qū)，全長3720bp，編碼826個氨基酸，分子量為120KD。HIF-1a含4個不同的結構域:(I) bHLH和PAS結構域，參與HIF-1 二聚化和介導DNA結合；(2) N-末端和C-末端的入核信號NLS，介導HIF-1 α轉位入核；(3)氧依賴性降解區(qū)域0DD，介導HIF-1 α的氧依賴性降解；(4)靠近N-末端的N-TAD和靠近C-末端的^々0，介導!1正-1(1的轉錄激活。C-TAD和N-TAD之間為抑制結構域，能降低TAD的活性，常氧下該抑制明顯，兩個入核信號只有C端的NLS才能介導HIF-1a入核。缺氧狀態(tài)下，腫瘤為了適應低氧環(huán)境，在能量代謝、血管生成、侵襲轉移等方面產生了一系列的變化，HIF-1 α就是啟動這一系列代謝和生物學行為改變的一個重要因子，在缺氧誘導的基因表達中起關鍵作用。研究發(fā)現(xiàn)，HIF-1 α在腫瘤細胞中參與調控的功能基因多達100種，主要有:(I)調控腫瘤血管新生，如血管內皮生長因子(VEGF)、血管生成素2 (Ang2)、誘導型一氧化氮合酶(iNOS)等；(2)參與糖代謝:糖酵解酶_11、醛縮酶A、葡萄糖載體I和3等；(3)介導腫瘤侵襲、轉移:趨化因子受體4 (CXCR4)、間質細胞衍生因子I(SDF1)、轉化生長因子β (TGF0 )等；(4)調節(jié)細胞凋亡:p53、BNIP3、RTP801等；(5)細胞增殖與分化:IGF2、EPO、TGF、FGF等。常氧狀態(tài)時，細胞在脯氨酰羥化酶(PHD)作用下，HIF-1 α中氧依賴降解區(qū)域(ODD)多肽序列內保守性的脯氨酸殘基被羥化，導致HIF-1a可與VHUVon Hippel Lindau)腫瘤抑制蛋白結 合，通過蛋白酶體泛素化途徑被降解。在缺氧狀態(tài)下，細胞脯氨酰羥化反應受阻，HIF-Ια未能羥基化而不能被VHL識別，因此HIF-Ια不能被泛素化和被蛋白酶體降解，使其在細胞漿內呈指數(shù)增長。HIF-1a在胞漿內積聚、活化、轉位至核內，與HIF-1 β形成具有轉錄活性的二聚體HIF-1，通過HIF-1 a C-末端的轉錄激活區(qū)域(C-TAD)誘導輔激活蛋白CBP/p300入核，p300-CBP復合物使HIF-1與CBP/ p300形成大分子復合物，并與受HIF-1 α調控的靶基因的啟動子或增強子內的一個或多個低氧應答元件(HRE)上的HIF-1結合位點(5' -TACGTG23')結合，誘導缺氧反應基因的轉錄。HIF-1a在結直腸癌、胃癌、卵巢癌、胰腺癌等多種實體瘤中高表達，且轉移性腫瘤中的表達比原發(fā)性腫瘤明顯較高。HIF-1 α的表達與腫瘤分期有關，臨床分期越晚HIF-1 a蛋白陽性表達率越高，HIF-1 α在腫瘤的發(fā)生發(fā)展、侵襲轉移和預后中起著關鍵的作用。目前研究認為，腫瘤缺氧狀態(tài)下HIF-1 α可以通過與其下游DNA結合，調節(jié)靶基因mRNA的表達，但HIF-1a的靶基因多達上百種，被HIF-1 α激活的眾多靶基因之間是如何相互作用、互相調節(jié)，目前研究的不多。HIF-1a自身活性的調控在很大的程度上決定了腫瘤細胞對氧分壓變化及細胞因子應答的敏感性及準確性，而在腫瘤中HIF-1 α調控的信號通路研究仍不夠明確。基于HIF-1 α的腫瘤信號轉導通路主要與腫瘤組織的缺氧狀態(tài)密切相關，以HIF-1 α分子為中心的信號轉導通路還有很多是未知的。隨著腫瘤機理研究的不斷深入，HIF-1 α的相關研究越來越多，其作用機制正逐步被揭示，但也存在著許多不足和問題，需要我們去進一步的深入研究和探討:針對HIF-1 a基因的靶向治療，直接從mRNA水平降低HIF-1 α的表達和轉錄活性是目前研究的熱點，但目前只能從細胞培養(yǎng)的實驗中得到證實，而臨床應用還很困難；HIFs不具有可直接檢測的活性，某些化學制劑和天然藥物提取物可抑制HIF-1 α的表達，沒有發(fā)現(xiàn)直接、特異性的以HIF-1a為靶點的藥物，目前國外已經開始致力于探尋臨床有效的HIF抑制劑，還沒有建立標準化的有效的篩選方法。
技術實現(xiàn)思路
針對目前缺乏有效的以HIF-1 α為靶點的抗腫瘤藥物篩選方法的問題，本專利技術提供了一種高效表達HIF-1 α基因的腸癌細胞，以及使用所述高效表達HIF-1 α基因的腸癌細胞篩選藥物的方 法。本專利技術提供的第一種篩選抗腫瘤藥物的方法，步驟包括: 步驟I，培養(yǎng)高效表達HIF-1 α基因的腸癌細胞； 步驟2，檢測待測藥物對所述細胞生長的抑制作用； 步驟3，根據(jù)待測藥物抑制作用的大小，判斷待測藥物是否為可用的抗腫瘤藥物。其中，步驟2中檢測方法可以是WST法、流式細胞術、MTI法或臺盼藍法。本專利技術提供的第二種篩選抗腫瘤藥物的方法，步驟包括: 步驟I，培養(yǎng)高效表達HIF-1 α基因的腸癌細胞； 步驟2，檢測待測藥物對所述細胞中HIF-1 α蛋白表達的影響； 步驟3，根據(jù)待測藥物影響作用的大小，判斷待測藥物是否為可用的抗腫瘤藥物。其中，步驟2中所述檢測方法優(yōu)選為流式細胞術檢測。本專利技術提供的第三者篩選抗腫瘤藥物的方法，步驟包括: 步驟I，培養(yǎng)高效表達HIF-1 α基因的腸癌細胞； 步驟2，檢測待測藥物對所述細胞中HIF-1 α基因mRNA表達的影響； 步驟3，根據(jù)待測藥物影響作用的大小，判斷待測藥物是否為可用的抗腫瘤藥物。其中，步驟2中所述檢測方法優(yōu)選為實時PCR檢測。本專利技術上述的篩選抗腫瘤藥物的方法中，所述高效表達HIF-1 α基因的腸癌細胞的制備方法如下: 步驟1，獲取目的基因編碼序列，將目的基因與慢病毒表達載體分別進行酶切；其中，所述目的基因為HIF-1 α基因、或該基因天然發(fā)生或人工發(fā)生的等位基因變異體；所述慢病毒表達載體包含HIV基本元件(如5’ LTR、3’ LTR以及其他輔助元件如WRE)、以及與HIF-1 α基因可操作地連接的調節(jié)序列(如啟動子，包括pCMV、pUb1、反轉錄病毒的LTR燈任何在真核細胞中有作用的啟動子); 步驟2，將所述目的基因編碼序列的酶切產物與慢病毒表達載體進行定向克隆連接，構建得到慢病毒載體重組質粒； 步驟3，提供慢病毒包裝系統(tǒng)，與所述重組質粒共轉染293T細胞，獲得慢病毒載體； 步驟4，慢病毒載體感染腸癌細胞。其中，所述腸癌細胞選自人結腸癌細胞、結腸腺癌細胞、直腸癌細胞、直腸腺癌細胞、結直腸癌細胞。并有優(yōu)選為結直腸癌細胞，進一步優(yōu)選為結直腸癌的貼壁細胞。上述的慢病毒載體和細胞株的制備方法，其中，獲取目的基因的方法為PCR方法釣取目的基因，所用引物含交換配對堿基、Ag本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種篩選抗腫瘤藥物的方法，其特征在于，步驟包括：步驟1，培養(yǎng)高效表達HIF?1α基因的腸癌細胞；步驟2，檢測待測藥物對所述細胞生長的抑制作用；步驟3，根據(jù)待測藥物抑制作用的大小，判斷待測藥物是否為可用的抗腫瘤藥物。

【技術特征摘要】

【專利技術屬性】
技術研發(fā)人員：李琦，范忠澤，周利紅，王炎，殷佩浩，慈書俊，周寧，李克桑，秦建民，陳星竹，吳瓊，
申請(專利權)人：上海市普陀區(qū)中心醫(yī)院，
類型：發(fā)明
國別省市：