一種對(duì)產(chǎn)ESBLs大腸桿菌產(chǎn)生耐藥性影響的中藥篩選方法，在96孔板上采用微量試管二倍稀釋法測(cè)定西藥和擬篩選中藥對(duì)產(chǎn)ESBLs大腸桿菌株的最小抑菌濃度，然后在培養(yǎng)基中加入亞抑菌濃度的中藥再次使用微量試管二倍稀釋法培養(yǎng)測(cè)定西藥的最小抑菌濃度；利用連續(xù)傳代法在加有同樣亞抑菌濃度中藥和同樣濃度西藥的培養(yǎng)基中傳代培養(yǎng)，直至觀測(cè)到的西藥最小抑菌濃度與傳代前相比變小4倍以上，即可判斷為該中藥對(duì)西藥具有耐藥逆轉(zhuǎn)作用。本發(fā)明專利技術(shù)不受細(xì)菌被中藥作用后是否仍能培養(yǎng)的限制，能夠避免中藥殺菌作用和耐藥逆轉(zhuǎn)作用的沖突，擴(kuò)大了中藥的篩選種類和范圍，操作方便，能夠準(zhǔn)確快速地判斷篩選結(jié)果。
【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】
本專利技術(shù)涉及。
技術(shù)介紹
大腸桿菌是常見的條件致病菌，即可原發(fā)引起雞急性敗血癥、腹膜炎、肝炎、肺炎、腸炎等多部位嚴(yán)重感染，亦可繼發(fā)或混發(fā)于病毒病，給養(yǎng)殖業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。其中阿莫西林、氨芐西林、頭孢噻呋、頭孢曲松、阿莫西林/克拉維酸、氨芐西林/舒巴坦等β -內(nèi)酰胺環(huán)類抗生素是防治該病的常用的重要藥物，隨著養(yǎng)殖規(guī)模集約化程度愈來(lái)愈大，用藥愈來(lái)愈泛濫，其耐藥菌株愈來(lái)愈多，關(guān)于大腸桿菌耐藥性報(bào)道較多，目前研究證實(shí)耐藥的主要機(jī)制之一是產(chǎn)生內(nèi)酰胺酶，尤其是超廣譜內(nèi)酰胺酶，以下簡(jiǎn)稱ESBLs，ESBLs可較強(qiáng)和快速的水解內(nèi)酰胺環(huán)，使這類抗生素喪失抗菌活性。ESBLs是β-內(nèi)酰胺酶的最主要酶型，ESBLs不僅對(duì)頭孢三代和氨曲南耐藥，而且對(duì)氨基糖苷類、喹諾酮類和磺胺類呈交叉耐藥，僅對(duì)碳青霉烯類、頭霉烯類藥物敏感。目前許多文獻(xiàn)已經(jīng)報(bào)道大腸桿菌的多重耐藥性與產(chǎn)生ESBLs有密切關(guān)系，國(guó)內(nèi)外對(duì)其較為關(guān)注。本人開展了雞源致病菌ESBLs的檢測(cè)、提取、酶對(duì)抗生素的水解率及舒巴坦、他唑巴坦以及中藥的抑酶保護(hù)作用等研究。對(duì)部分ESBLs大腸桿菌的藥敏試驗(yàn)表明，其多重耐藥率明顯高于非ESBLs菌株。另外結(jié)果還表明產(chǎn)ESBLs菌株不僅對(duì)頭孢噻呋等第三代頭孢菌素嚴(yán)重耐藥，而且亦對(duì)氟喹諾酮類、氨基糖苷類和磺胺類等多種抗菌藥耐藥，呈嚴(yán)重的多重耐藥。目前細(xì)菌耐藥性已成為人類的巨大挑戰(zhàn)，尤其在2010年出現(xiàn)的“超級(jí)細(xì)菌”，使人類更加意識(shí)到耐藥性細(xì)菌對(duì)人類產(chǎn)生的威脅。在2010年9月9日的《信息時(shí)報(bào)》中有報(bào)道稱，超級(jí)細(xì)菌無(wú)藥可治。鐘南山院士提到濫用抗生素等于作繭自縛。還有報(bào)道提到未來(lái)十年，全世界將無(wú)抗生素可以應(yīng)對(duì)超級(jí)細(xì)菌，如果濫用抗生素的勢(shì)頭不能得到遏制，人類將回到無(wú)抗生素時(shí)代，也就意味著重新回到用中藥進(jìn)行治療的時(shí)代。目前關(guān)于研究中藥 對(duì)耐藥菌的耐藥性影響的研究報(bào)道也較多，其中的研究方法主要有兩種:一種是影印藥理學(xué)方法，另一種是耐藥質(zhì)粒消除方法。這兩種方法成功的條件是中藥作用細(xì)菌后，必須保證被作用后的細(xì)菌還能繼續(xù)存活才能被培養(yǎng)成功再進(jìn)行下一步耐藥消除的驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)。由于中藥成分復(fù)雜，可以多靶位地作用于細(xì)菌，影響細(xì)菌不同階段的生長(zhǎng)，進(jìn)而影響細(xì)菌不同的部位和不同的繁殖生長(zhǎng)代謝環(huán)節(jié)，所以，不是所有中藥作用細(xì)菌消除耐藥性后仍能保證細(xì)菌生長(zhǎng)。而利用上述兩種方法進(jìn)行篩選，只有不影響細(xì)菌生長(zhǎng)的中藥才能被篩選出來(lái)，嚴(yán)重地縮小了篩選中藥的范圍，另外還存在篩選時(shí)作用時(shí)間長(zhǎng)短難以判斷、篩選速度慢、操作繁瑣和結(jié)果準(zhǔn)確性難以判斷的缺點(diǎn)。因此，實(shí)際生產(chǎn)中迫切需要一種可以快速準(zhǔn)確地對(duì)耐藥菌產(chǎn)生耐藥影響的中藥篩選方法。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
本專利技術(shù)的目的是針對(duì)上述現(xiàn)有技術(shù)存在的不足，提供，使中藥作用后的細(xì)菌無(wú)論是否能存活都能驗(yàn)證中藥是否具有耐藥性影響作用，擴(kuò)大篩選的中藥和西藥范圍，準(zhǔn)確快速地判斷篩選結(jié)果。本專利技術(shù)實(shí)現(xiàn)上述目的所采取的技術(shù)方案是:，包括以下步驟:(I)將耐藥產(chǎn)ESBLs的大腸桿菌菌株進(jìn)行分離，鑒定，并保存?zhèn)溆茫?2)在第一批96孔板上，采用微量試管二倍稀釋法，分別測(cè)定西藥和擬篩選中藥對(duì)步驟(I)得到的耐藥產(chǎn)ESBLs的大腸桿菌菌株的最小抑菌濃度，從而得出西藥的最小抑菌濃度和擬篩選中藥的亞抑菌濃度；(3)根據(jù)步驟(2)所得的擬篩選中藥的亞抑菌濃度，在培養(yǎng)基中加入亞抑菌濃度的擬篩選中藥后，將該培養(yǎng)基加入第二批96孔板中，在第二批96孔板上再次采用微量試管二倍稀釋法，測(cè)定西藥對(duì)耐藥產(chǎn)ESBLs的大腸桿菌菌株的最小抑菌濃度；(4)根據(jù)步驟(2)所得的擬篩選中藥的亞抑菌濃度，在培養(yǎng)基中加入亞抑菌濃度的擬篩選中藥后，將該培養(yǎng)基加入第三批96孔板中；按照步驟(3)中的第二批96孔板上所有長(zhǎng)菌的孔所對(duì)應(yīng)的西藥濃度，在第三批96孔板中加入同樣濃度的西藥，再采用連續(xù)傳代法，將第二批96孔板上所有長(zhǎng)菌的孔上的菌傳至加有同樣濃度西藥的第三批96孔板中進(jìn)行傳代，培養(yǎng)16h后觀測(cè)西藥的最小抑菌濃度；(5)按照步驟(4)所述的連續(xù)傳代法，將第三批96孔板上所有長(zhǎng)菌的孔上的菌傳至加有同樣亞抑菌濃度擬篩選中藥和同樣濃度西藥的第四批96孔板中進(jìn)行傳代，培養(yǎng)16h后觀測(cè)西藥的最小抑菌濃度；依此傳代，直至觀測(cè)到的西藥最小抑菌濃度與步驟(3)所得的西藥最小抑菌濃度相比變小4倍以上，即判斷擬篩選中藥對(duì)耐藥產(chǎn)ESBLs的大腸桿菌菌株具有耐藥逆轉(zhuǎn)作用，即擬篩選中藥和西藥體外作用于耐藥產(chǎn)ESBLs的大腸桿菌菌株具有較好的抑制作用。 所述的傳代的傳代數(shù)不超過(guò)10代。本專利技術(shù)與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有以下有益效果:(I)能夠準(zhǔn)確快速地判斷擬篩選中藥降低西藥最小抑菌濃度的作用時(shí)間，以及隨著作用時(shí)間的延長(zhǎng)引起西藥最小抑菌濃度變化的準(zhǔn)確值。(2)能夠一次性篩選擬篩選中藥影響的大量西藥，一個(gè)96孔板至少能夠篩選8個(gè)西藥，效率高。(3)操作方便。(4)不受細(xì)菌被中藥作用后是否仍能培養(yǎng)的限制，能夠避免中藥殺菌作用和耐藥逆轉(zhuǎn)作用的沖突，擴(kuò)大了中藥的篩選種類和范圍。(5)能夠判斷中藥和西藥之間的關(guān)系，如拮抗、協(xié)同、增強(qiáng)和是否隨著作用時(shí)間的增長(zhǎng)而增加西藥的最小抑菌濃度值。具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本專利技術(shù)的技術(shù)方案做進(jìn)一步說(shuō)明。實(shí)施例1對(duì)產(chǎn)TEM型大腸桿菌具有耐藥逆轉(zhuǎn)作用的澤蘭中藥的篩選，按照以下步驟進(jìn)行: (I)采用常規(guī)產(chǎn)ESBLs大腸桿菌初篩方法篩選產(chǎn)酶菌株，然后用PCR擴(kuò)增方法進(jìn)行確證產(chǎn)ESBLs類型為TEM型，保存?zhèn)溆茫?2)在第一批96孔板上，采用微量試管二倍稀釋法，測(cè)定澤蘭對(duì)耐藥產(chǎn)ESBLs的大腸桿菌菌株的亞抑菌濃度，測(cè)定西藥的最小抑菌濃度，西藥為阿莫西林、環(huán)丙沙星、諾氟沙星、左旋氧氟沙星、克林沙星、磺胺間甲氧嘧啶鈉、加替沙星和氟苯尼考。(3)根據(jù)步驟(2)所得的澤蘭的亞抑菌濃度，在培養(yǎng)基中加入亞抑菌濃度的澤蘭后，將該培養(yǎng)基加入第二批96孔板中，在第二批96孔板上再次采用微量試管二倍稀釋法，分別測(cè)定阿莫西林、環(huán)丙沙星、諾氟沙星、左旋氧氟沙星、克林沙星、磺胺間甲氧嘧啶鈉、力口替沙星和氟苯尼考對(duì)耐藥產(chǎn)ESBLs的大腸桿菌菌株的最小抑菌濃度；(4)根據(jù)步驟(2)所得的澤蘭的亞抑菌濃度，在培養(yǎng)基中加入亞抑菌濃度的澤蘭后，將該培養(yǎng)基加入第三批96孔板中；按照步驟(3)中的第二批96孔板上所有長(zhǎng)菌的孔所對(duì)應(yīng)的各種西藥濃度，在第三批96孔板中加入同樣濃度的各種西藥，再采用連續(xù)傳代法，將第二批96孔板上所有長(zhǎng)菌的孔上的菌傳至加有同樣濃度西藥的第三批96孔板中進(jìn)行傳代，培養(yǎng)16h后觀測(cè)并記錄各種西藥的最小抑菌濃度；(5)按照步驟(4)所述的連續(xù)傳代法，將第三批96孔板上所有長(zhǎng)菌的孔上的菌傳至加有同樣亞抑菌濃度澤蘭和同樣濃度西藥的第四批96孔板中進(jìn)行傳代，培養(yǎng)16h后觀測(cè)并記錄西藥的最小抑菌濃度；依此繼續(xù)傳代，直至觀測(cè)到的西藥最小抑菌濃度與步驟(3)所得的西藥最小抑菌濃度相比變小4倍以上。篩選結(jié)果記錄如下表所示:亞抑菌濃度澤蘭培養(yǎng)基傳代引起產(chǎn)ESBLs大腸桿菌西藥最小抑菌濃度的變化(ug/ml)權(quán)利要求1.，其特征在于，包括以下步驟: (1)將耐藥產(chǎn)ESBLs的大腸桿菌菌株進(jìn)行分離，鑒定，并保存?zhèn)溆茫? (2)在第一批96孔板上，采用微量試管二倍稀釋法，分別測(cè)定西藥和擬篩選中藥對(duì)步驟(I)得到的耐藥產(chǎn)ESBLs的大腸桿菌菌株的最小抑菌濃度，從本文檔來(lái)自技高網(wǎng)...
【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
一種對(duì)產(chǎn)ESBLs大腸桿菌產(chǎn)生耐藥性影響的中藥篩選方法，其特征在于，包括以下步驟：（1）將耐藥產(chǎn)ESBLs的大腸桿菌菌株進(jìn)行分離，鑒定，并保存?zhèn)溆茫唬?）在第一批96孔板上，采用微量試管二倍稀釋法，分別測(cè)定西藥和擬篩選中藥對(duì)步驟（1）得到的耐藥產(chǎn)ESBLs的大腸桿菌菌株的最小抑菌濃度，從而得出西藥的最小抑菌濃度和擬篩選中藥的亞抑菌濃度；（3）根據(jù)步驟（2）所得的擬篩選中藥的亞抑菌濃度，在培養(yǎng)基中加入亞抑菌濃度的擬篩選中藥后，將該培養(yǎng)基加入第二批96孔板中，在第二批96孔板上再次采用微量試管二倍稀釋法，測(cè)定西藥對(duì)耐藥產(chǎn)ESBLs的大腸桿菌菌株的最小抑菌濃度；（4）根據(jù)步驟（2）所得的擬篩選中藥的亞抑菌濃度，在培養(yǎng)基中加入亞抑菌濃度的擬篩選中藥后，將該培養(yǎng)基加入第三批96孔板中；按照步驟（3）中的第二批96孔板上所有長(zhǎng)菌的孔所對(duì)應(yīng)的西藥濃度，在第三批96孔板中加入同樣濃度的西藥，再采用連續(xù)傳代法，將第二批96孔板上所有長(zhǎng)菌的孔上的菌傳至加有同樣濃度西藥的第三批96孔板中進(jìn)行傳代，培養(yǎng)16h后觀測(cè)西藥的最小抑菌濃度；（5）按照步驟（4）所述的連續(xù)傳代法，將第三批96孔板上所有長(zhǎng)菌的孔上的菌傳至加有同樣亞抑菌濃度擬篩選中藥和同樣濃度西藥的第四批96孔板中進(jìn)行傳代，培養(yǎng)16h后觀測(cè)西藥的最小抑菌濃度；依此傳代，直至觀測(cè)到的西藥最小抑菌濃度與步驟（3）所得的西藥最小抑菌濃度相比變小4倍以上，即判 斷擬篩選中藥對(duì)耐藥產(chǎn)ESBLs的大腸桿菌菌株具有耐藥逆轉(zhuǎn)作用，即擬篩選中藥和西藥體外作用于耐藥產(chǎn)ESBLs的大腸桿菌菌株具有較好的抑制作用。...
【技術(shù)特征摘要】
【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：司紅彬，黃凱，夏娟，蔣利和，何家康，何山紅，王秋華，梁晶晶，鄭艷青，宋劍武，
申請(qǐng)(專利權(quán))人：廣西大學(xué)，
類型：發(fā)明
國(guó)別省市：
還沒(méi)有人留言評(píng)論。發(fā)表了對(duì)其他瀏覽者有用的留言會(huì)獲得科技券。