本發明專利技術涉及一種異源表達內切葡聚糖酶基因的木霉工程菌及其應用，所述的工程菌攜帶有能表達特異腐質霉(Humicola?insolens)的內切葡聚糖酶的表達載體。本發明專利技術的木霉工程菌能高效表達特異腐質霉(Humicola?insolens)的內切葡聚糖酶基因，從而增加了其纖維素酶系的內切酶組分，改變了酶學pH特性，明顯擴大了其纖維素酶系在中性和堿性條件下的適用范圍；本發明專利技術生產的纖維素酶產品在pH?4.0-8.0范圍內，無需調酸可直接應用于水洗做舊、織布拋光等紡織工業領域，且效果良好，從而簡化了應用工藝，節約成本。
【技術實現步驟摘要】
:本專利技術屬于微生物工程
，具體涉及一種異源表達內切葡聚糖酶基因的工程菌株及其應用。
技術介紹
纖維素是由β -1，4-糖苷鍵連接而成D-吡喃式葡萄糖聚合物，是地球上最豐富且可再生的資源。據估計，地球上每年光合作用產生1.5 X IO11億噸纖維素(Ryu，D.D等，1980，Enzyme and Microbial Technology)。多數情況下,要高值化利用纖維素首先必須通過纖維素酶對其進行有效降解。自然界中產纖維素酶的生物很多，主要是微生物，如絲狀真菌、細菌和放線菌等。因此，對產纖維素酶微生物的篩選或遺傳改造研究及應用就受到了普遍的關注。自然界中各種微生物所產的纖維素酶組分和比例不盡相同，例如絲狀真菌纖維素酶系(Cellulase system) 一般包括3種水解酶，即內切型β _1，4_葡聚糖(Endoglucanase, EC3.2.1.4)、外切型 β -1,4-葡聚糖酶(Exo-glucanase, EC3.2.1.91)和β _ 葡萄糖苷酶(β -Glucosidase, EC3.2.1.21) (Fogarty M, Kelly C Τ, 1990, MicrobialEnzymes and Biotechnology), 3種纖維素酶組分協同作用才能將纖維素水解成葡萄糖。其中木霉(Trichoderma sp.)作為工業化生產纖維素酶的菌株，其纖維素酶系中有2個外切酶組分(Cbh I和Cbh II)和5個內切酶組分(Eg 1、Eg II,Eg III,Eg IV和Eg V)。由于木霉具有高效分泌表達和高密度發酵等優點，常被用來構建工程菌生產其它工業酶。而利用基因工程手段高效表達外源基因，也是改變木霉宿主酶系組成的重要方法之一，如通過高效表達異源β_葡萄糖苷酶基因，可以有效彌補木霉纖維素酶系中β_葡萄糖苷酶的不足，提高菌株的濾紙酶活(Jiwei Zhang等,2010, Bioresource Technology)。目前,纖維素酶系中的各組分均可在木霉中得到有效表達需要提及的是，木霉纖維素酶系的最適pH值為4.5-5.5，在近中性和堿性條件下(pH6.5-8.0)幾乎沒有效果。因此，在織布除毛、牛仔布磨損和洗舊的現有工藝中，必須先調pH至酸性，再加纖維素酶。為了進一步簡化工序,節約生產成本和勞動量,急需通過遺傳工程方法獲得在中性和堿性條件下適用的纖維素酶系。
技術實現思路
本專利技術的目的是提供一種異源表達內切葡聚糖酶基因的木霉工程菌及其應用，即利用基因工程手段，將特異腐質霉(Humicola insolens)的內切葡聚糖酶基因轉化入木霉中，構建木霉工程菌株。該工程菌能高效表達內切葡聚糖酶基因，從而增加了其纖維素酶系的內切酶組分，提高了酶活性；而意想不到的是，與未轉化的木霉相比，本專利技術構建的木霉工程菌的纖維素酶系的PH適用范圍得到了顯著擴大，可以在中性或偏堿性條件下直接應用。申請人:在經過長期的篩選后發現 ，將來自于特異腐質霉(Humicola insolens)的內切葡聚糖酶基因轉化入木霉中，木霉纖維素酶系的pH適用范圍得到了顯著擴大，從而促成了本專利技術。本專利技術的一個方面涉及一種木霉工程菌，該工程菌攜帶有能表達特異腐質霉(Humicola insolens)的內切葡聚糖酶的表達載體。所述的木霉為里氏木霉(Trichoderma reesei)、康氏木霉(Trichodermakoningii)、長枝木霉(Trichoderma 1ngibrachiatum)、哈茨木霉(Trichodermaharzianum)、綠色木霉(Trichoderma viride)、鉤狀木霉(Trichoderma hamatum)中的任一種。其中里氏木霉YFZX-1 (hph+, egV) (Trichoderma reesei YFZX-1 (hph+, egV))工程菌，已于2011年12月13日，保藏于地址為武漢大學生命科學學院武漢市武昌珞珈山的“中國典型培養物保藏中心”，保藏號為CCTCC NO:M 2011469。康氏木霉YFZX-2 (egv) (Trichoderma koningii YFZX-2 (egv))工程菌，已于 2011年12月13日，保藏于“中國典型培養物保藏中心”，保藏號為CCTCC NO:M 2011470。綠色木霉YFZX-3 (hph+, egV) (Trichoderma viride YFZX-3 (hph+, egV))工程菌，已于2011年12月13日，保藏于“中國典型培養物保藏中心”，保藏號為CCTCC NO:M 2011471。上述的特異腐質霉(Humicola insolens)的內切葡聚糖酶,其特征在于:I)其氨基酸序列為SEQ ID NO:1的內切葡聚糖酶；2)在I)中限定的氨基酸中經過取代、缺失或添加一個或幾個氨基酸且具有特異腐質霉的內切葡聚糖酶功能的，由I)衍生的蛋白質。上述的特異腐質霉的內切葡聚糖酶的編碼基因，其核苷酸序列為SEQ ID NO:2。所述的表達載體，其啟動子序列為木霉cbhl啟動子，終止子序列為木霉cbhl終止子，篩選標記為潮霉素，其一種圖譜如圖1所示。本專利技術另一方面涉及上述木霉工程菌的應用，用于生產纖維素酶系，所述纖維素酶系可在中性或堿性條件下適用。上述生產的纖維素酶在紡織工業領域中的應用，尤其在針織面料、梭織面料的表面除毛，針織面料、梭織面料的除毛染色一浴工藝，針織面料、梭織面料的除毛除氧一浴工藝以及牛仔面料的起花及除毛等領域的使用方法。本專利技術的木霉工程菌能高效表達特異腐質霉(Humicola insolens)的內切葡聚糖酶基因，從而增加了其纖維素酶系的內切酶組分，改變了酶學PH特性，明顯擴大了其纖維素酶系在中性和堿性條件下的適用范圍；本專利技術生產的纖維素酶產品在PH 4.0-8.0范圍內，無需調酸可直接應用于水洗做舊、織布拋光等紡織工業領域，且效果良好，從而簡化了應用工藝，節約成本。附圖說明圖1:構建的重組表達載體不意圖；圖2:PCR擴增鑒定轉化子的電泳圖；其中:A為PCR擴增潮霉素基因部分序列；B為PCR擴增目的基因；圖3 =SDS-PAGE鑒定木霉工程菌所表達的目的蛋白:箭頭所示為內切葡聚糖酶。圖4:木霉工程菌YFZX-1所產纖維素酶的pH特性分析。具體實施例方式下面結合實例對本專利技術的方法做進一步說明。但實例僅限于說明，并不限于此。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常可按常規條件，如J.薩姆布魯克(Sambrook)等編寫的《分子克隆實驗指南》中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件運行。本領域相關的技術人員可以借助實施例更好地理解和掌握本專利技術。但是，本專利技術的保護和權利要求范圍不限于所提供的案例。實施例1特異腐質霉內切葡聚糖酶基因的克隆1.1提取特異腐質霉總基因組DNA將特異腐質霉(Humicola sp.)過夜培養,取適量菌體置于離心管中，13000rpm離心 5min，棄上清；加入 400 μ I 抽提緩沖液(IOOmM Tris-HCl, IOOmM EDTA, 250mM NaCl, I %SDS);然后加IOOmg石英砂或玻璃珠，在珠打儀劇烈振蕩2min左右；65°C水浴20min后本文檔來自技高網...
【技術保護點】
一種木霉工程菌，為攜帶有能表達特異腐質霉(Humicola?insolens)內切葡聚糖酶的表達載體的木霉。
【技術特征摘要】
【專利技術屬性】
技術研發人員：黃亦鈞，張青，王華明，許韡，
申請(專利權)人：青島蔚藍生物集團有限公司，上海康地恩生物科技有限公司，
類型：發明
國別省市：
還沒有人留言評論。發表了對其他瀏覽者有用的留言會獲得科技券。