本發明專利技術的目的在于提供一種蘋果樹腐爛病菌轉化子及其制備方法。該方法將含有二元載體的根癌農桿菌與腐爛病菌的分生孢子懸浮液混合后共培養，用抗生素篩選，獲得轉化子。該方法以蘋果樹腐爛病菌的分生孢子為受體，以根癌農桿菌為介體，克服了蘋果樹腐爛病菌原生質體制備困難，且聚乙二醇(PEG)介導的轉化效率低等原因導致的腐爛病菌遺傳轉化困難的問題。該方法的轉化效率可達1/103個分生孢子。本發明專利技術同時提供了一種蘋果樹腐爛病菌綠色熒光蛋白(GFP)標記菌株及其制備方法，該方法獲得的轉化子，表達強的綠色熒光蛋白的效率可達96.7%。
【技術實現步驟摘要】
本專利技術屬于微生物基因工程
，具體涉及一種蘋果樹腐爛病菌轉化子及其制備方法，同時還提供一種蘋果樹腐爛病菌GFP標記菌株及其制備方法。
技術介紹
黑腐皮殼菌(Valsa ceratosperma)引起的蘋果樹腐爛病,是對蘋果產業威脅最大的一種毀滅性病害，該病在我國蘋果產區發生普遍，可造成果樹主干及整樹死亡，甚至毀園(陳策，1987 ;2009)。自1916年蘋果樹腐爛病在遼寧省南部地區發現以來，該病已在我國有過幾次大流行，造成了嚴重的產量和經濟損失(陳策等，1980 ;2009)。隨著我國蘋果種植結構和栽培制度的調整，腐爛病已成為限制我國蘋果產業發展的主要因子。2008年，國家蘋果產業技術體系調查顯示，全國范圍內蘋果樹腐爛病的總體發生率為52. 7%，部分地區發病率高達85%以上(曹克強等，2009)。2011年，山東煙臺蘋果產區腐爛病再次嚴重發生，本課題 組調查發現，旺盛結果期的蘋果樹具有新病疤的病株率為68. 20%，死株率為2. 76% (王彩霞等，2012)。針對蘋果樹腐爛病造成的嚴重危害及防治困難等問題，引起了國內外相關科研工作者及多國政府部門的高度重視，該病現在仍被列為歐洲的主要檢疫對象(http//WWW.eppo. orR)。我國自上世紀50年代以來,對蘋果樹腐爛病的發生和流行規律、防治技術及病原學等進行了系統研究，取得了許多有意義的成果。目前生產上對于腐爛病的防控，采取的措施主要包括加強栽培管理、噴藥保護、及時刮治病斑等，但這些措施都未能有效控制病害的發生和流行。其中一個重要原因是對于腐爛病菌的侵染、致病過程與致病機理尚不清楚，制約了對病害發生、流行規律的深入了解，導致病害防治工作低效、盲目和被動，造成腐爛病的危害近年來仍在逐年加重。植物病原菌侵染致病過程的研究，對于病害防控具有重要的實踐價值，可以為施藥提供一定的科學依據，如施藥時期、施藥部位、施藥次數等，還可根據抗感病品種不同的侵染過程而篩選抗病品種。對于真菌侵染過程的研究，多采用切片染色結合電子顯微鏡觀察的方法進行，但對于木本植物的枝干類病害如蘋果樹腐爛病、枝干輪紋病等，由于材料木質化程度高，采用傳統的技術方法很難取得理想的觀察效果，這也是該類病害侵染致病過程研究無法取得突破性進展的主要原因之一。隨著生物技術和分子生物學的不斷發展，利用分子標記如綠色熒光蛋白(GFP)研究病原菌的侵染過程與致病機理已成為可能(Spellig et al.，1996)。因此，在目前缺乏有效抗腐爛病品種及殺菌劑的前提下，利用GPF標記菌株揭示腐爛病菌的侵染致病過程及其潛伏位點，明確其致病機理及其與寄主的互作機制，將為蘋果樹腐爛病的有效、安全控制提供新的指導思路，為生產上科學、高效地防控腐爛病提供堅實的理論基礎。綠色突光蛋白(green fluorescent protein, GFP)作為一種重要的報告基因，在病原菌的侵染致病過程、病原菌在寄主組織中的發育和形態觀察、致病機理及其病原物-寄主互作研究等諸多方面均顯示了良好的應用前景(Chen et al. , 2003;Dueketal. , 2004;Sarrocco et al. , 2007;Rajasekaran et al. , 2008;Mansouri et al.,2009;Pliego et al.，2009)。在植物病原真菌中，GFP標記技術也已得到廣泛應用，并取得了前所未有的成果，受到植物病理學家的高度關注。對于蘋果樹腐爛病菌而言，由于其功能基因尚未被克隆，因此，要得到其GFP標記菌株，首先必須建立高效、穩定的腐爛病菌遺傳轉化技術體系。目前廣泛采用的真菌轉化方法有聚乙二醇(PEG)介導的原生質體轉化法、電激法、醋酸鋰法、限制性內切酶介導法(REMI)和基因槍轉化法等，這些方法大都需以原生質體為受體。高靜等(2011)報道了 PEG介導的蘋果樹腐爛病菌原生質體遺傳轉化法，轉化效率為44個/μ g DNA，作者僅得到218個轉化子。有大量報道稱原生質體制備繁瑣，或不同批次的酶活性不一致，導致原生質體制備試驗不能很好的重復(Weld et al. , 2006; Levyet et al. , 2008;Bashi Zafer Dallal et al.，2010),是使用原生質體作為轉化受體的主要問題。因此原生質體作為轉化受體，仍有問題需要解決。針對這一問題，許多學者提出了一些改進技術和新方法，其中最有效的是根癌農桿菌介導的真菌遺傳轉化法(Agrobacteriumt umefaciens-mediated transformation, ATMT),在多種絲狀真菌的遺傳轉化中得到成功應用，高靜(2011，碩士論文)初步建立了蘋果樹腐爛病菌的ATMT轉化體系，但是轉化效率極低，每IO6個分生孢子僅得到6個轉化子?？傊?，目前缺乏高效、穩定的蘋果樹腐爛病菌遺傳轉化技術體系，更沒有關于腐爛病菌GFP標記方法的報道，成為腐爛病菌侵染致病過程與機理研究的瓶頸。因此，建立新的高效的蘋果樹腐爛病菌遺傳轉化體系，獲得穩定表達綠色熒光蛋白的標記菌株，對于推動腐爛病菌侵染致病過程的組織學研究及其分子生物學研究具有重大意義。
技術實現思路
本專利技術的目的在于提供一種制備蘋果樹腐爛病菌轉化子的方法及制 備GFP標記腐爛病菌的方法。本專利技術一個方面提供一種制備蘋果樹腐爛病菌轉化子的方法，包括以下步驟A.制備平果樹腐爛病囷分生抱子( U將蘋果樹腐爛病菌接種于PDA培養基上，活化培養3天；(2)將活化培養的腐爛病菌打取菌餅接種于含有大麥粒的PDA培養基上，恒溫培養20-30天，至橘黃色分生孢子角溢出；B.培養農桿菌(I)將質粒pBIG3C (由中國農業大學彭友良教授饋贈)轉入農桿菌中；(2)取步驟B(I)中的農桿菌單菌落接種于含有卡那霉素、利福平和鏈霉素的LB液體培養基中，28°C震蕩培養I天；(3)取步驟B (2)中的農桿菌菌液于含卡那霉素的基本培養基中，28°C震蕩培養2 天，測量菌液的OD6c 值；(4)用含有乙酰丁香酮和2- (N-嗎啉基)乙磺酸鈉的頂培養基稀釋步驟B (3) 中的農桿菌懸浮液至0D_值為O. 15，繼續在28°C條件下振蕩培養6h備用；C.根癌農桿菌與蘋果樹腐爛病菌分生孢子共培養(I)取步驟A (2)中的蘋果樹腐爛病菌分生孢子角至步驟B (4)中的農桿菌懸浮液中，用農桿菌溶液稀釋混合均勻，調節濃度至IO6個分生孢子/mL ；(2)將步驟C (I)中的農桿菌-腐爛病菌分生孢子混合液，按200 μ L/皿的量均勻涂布于鋪有玻璃紙的含有乙酰丁香酮和2- (N-嗎啉基)乙磺酸鈉的Co-M培養基上，置于25°C共培養3 5天；D.轉化子的篩選及保存(I)將步驟C (2)中的玻璃紙放于一空的無菌培養皿中，使有菌絲的一面朝上，玻璃紙上面覆蓋含有潮霉素和頭孢霉素PDA培養基，置于25°C恒溫箱中培養3飛天；(2)將長出的腐爛病菌菌落轉移至含有潮霉素的PDA平板中繼續培養，將能繼續生長的菌落再次接種至含有潮霉素的PDA平板上，連續培養三代得到蘋果樹腐爛病菌轉化子;·(3)將得到的轉化子保存在含有50 μ g/mL潮霉素的PDA斜面培養基上，置于4°C冰箱中保存。根據本專利技術的具體示例，步驟A中培養本文檔來自技高網...
【技術保護點】
一種制備蘋果樹腐爛病菌轉化子的方法，其特征在于，包括以下步驟：A.制備蘋果樹腐爛病菌分生孢子：（1）將蘋果樹腐爛病菌接種于PDA培養基上，活化培養3天；（2）將活化培養的腐爛病菌打取菌餅接種于含有大麥粒的PDA培養基上，25℃恒溫培養20?30天，至橘黃色分生孢子角溢出；B.培養農桿菌：（1）將質粒pBIG3C轉入農桿菌中；（2）取步驟B（1）中的農桿菌單菌落接種于含有卡那霉素、利福平和鏈霉素的LB液體培養基中，28℃震蕩培養1天；（3）取步驟B（2）中的農桿菌菌液于含卡那霉素的基本培養基中，28℃震蕩培養2天，測量菌液的OD600值；（4）用含有乙酰丁香酮和2?（N?嗎啉基）乙磺酸鈉的IM培養基稀釋步驟B（3）中的農桿菌懸浮液至OD600值為0.15，繼續在28℃條件下振蕩培養6h備用；C.根癌農桿菌與蘋果樹腐爛病菌分生孢子共培養：（1）取步驟A（2）中的蘋果樹腐爛病菌分生孢子角至步驟B（4）中的農桿菌懸浮液中，用農桿菌溶液稀釋混合均勻，調節濃度至106個分生孢子/mL；（2）將步驟C（1）中的農桿菌?腐爛病菌分生孢子混合液，按200μL/皿的量均勻涂布于鋪有玻璃紙的含有乙酰丁香酮和2?（N?嗎啉基）乙磺酸鈉的Co?IM培養基上，置于25℃共培養3~5天；D.轉化子的篩選及保存（1）將步驟C（2）中的玻璃紙放于一空的無菌培養皿中，使有菌絲的一面朝上，玻璃紙上面覆蓋含有潮霉素和頭孢霉素的PDA培養基，置于25℃恒溫箱中培養3~5天；（2）將長出的腐爛病菌菌落轉移至含有潮霉素的PDA平板中繼續培養，將生長的菌落再次接種至含有潮霉素的PDA平板上，連續培養三代得到蘋果樹腐爛病菌轉化子；（3）將得到的轉化子保存在含有50μg/mL潮霉素的PDA斜面培養基上，置于4℃低溫保存。...
【技術特征摘要】
【專利技術屬性】
技術研發人員：王彩霞，李保華，王海艷，李桂舫，董向麗，張清明，
申請(專利權)人：青島農業大學，
類型：發明
國別省市：
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