一株檸檬酸高產(chǎn)菌株及其篩選方法技術

本發(fā)明專利技術涉及生物發(fā)酵領域，涉及了一株采用航天誘變手段獲得的黑曲霉孢子，通過耐受高糖高酸的定向篩選，設計出高效的科學篩選方案從而實現(xiàn)誘變選育獲得高產(chǎn)菌株，該菌株命名為TN-A09，發(fā)明專利技術人對其進行了生物保藏，其保藏號為CGMCCNo.5751，該菌株是耐高糖高酸、產(chǎn)酸高、轉化率高的檸檬酸生產(chǎn)菌株，利用其發(fā)酵生產(chǎn)檸檬酸，平均產(chǎn)酸達到18%，發(fā)酵周期60小時，轉化率99%，遠高于黑曲霉液體發(fā)酵檸檬酸現(xiàn)有技術水平。

【技術實現(xiàn)步驟摘要】

本專利技術涉及生物發(fā)酵領域，涉及一株采用航天誘變手段獲得的黑曲霉孢子，并通過耐受:聞糖聞酸的定向篩選獲得聞廣朽1fe酸菌株。
技術介紹
檸檬酸(Citric acid)又名枸櫞酸，為白色顆粒狀或白色結晶粉末，相對密度為1.6550，無臭，具有令人愉快的強烈的酸味，入口爽快，無后酸味，安全無毒，被廣泛用作食品和飲料的酸味劑，全球范圍內(nèi)檸檬酸的生產(chǎn)主要通過產(chǎn)檸檬酸的黑曲霉發(fā)酵，黑曲霉屬半知菌綱，一般只進行無性繁殖，由孢子發(fā)芽開始到新孢子形成，為一個生活周期。黑曲霉利用糖類發(fā)酵生成檸檬酸，其生物合成途徑現(xiàn)普遍認為是:葡萄糖經(jīng)EMP、HMP途徑降解生成丙酮酸，丙酮酸一方面氧化脫羧生成乙酰CoA，另一方面經(jīng)CO2固定化反應生成草酰乙酸，草酰乙酸與乙酰CoA縮合生成檸檬酸。檸檬酸 的工業(yè)生產(chǎn)通常采用黑曲霉進行的深層發(fā)酵法，原料以薯干和玉米為主。世界檸檬酸工業(yè)的集約化程度非常高，除中國外，國外主要的檸檬酸制造商只有5 6家(美國、奧地利、加拿大、巴西等)，到2011年我國檸檬酸產(chǎn)量達94萬噸，占世界總產(chǎn)量的70%左右，從產(chǎn)量來說是名副其實的生產(chǎn)大國。我國檸檬酸工業(yè)的集約化已經(jīng)達到世界領先水平。隨著工業(yè)的發(fā)展人們對含檸檬酸產(chǎn)品的需求增加，而黑曲霉菌株的產(chǎn)酸能力是制約檸檬酸生產(chǎn)能力的一個瓶頸。因此篩選獲得高產(chǎn)檸檬酸的黑曲霉菌株具有重大意義。國內(nèi)外有很多關于檸檬酸生產(chǎn)菌黑曲霉育種的研究報道，主要是采用物理和化學手段進行誘變育種。各種誘變劑有其作用的特殊性，人們還無法針對某一目的選擇最適宜的誘變劑，在實際工作中一般都是根據(jù)經(jīng)驗來證明誘變效果較好的因素。自從上世紀初開始用微生物生產(chǎn)檸檬酸以來，人們對生產(chǎn)檸檬酸的菌種進行了幾十年的誘變研究。我國在檸檬酸生產(chǎn)菌黑曲霉的育種方面積累了豐富的經(jīng)驗，認為用復合誘變的方法比用單一的物理方法或化學方法更為有效。目前來看對黑曲霉育種較為有效的誘變因子有:Y-射線、X-射線、紫外線、激光、亞硝基胍(NTG)、亞硝基脲、乙基胺等，此外還有高能電子流、電磁場等。利用這些誘變因子在黑曲霉育種工作中已取得了不少成果。20世紀50年代末和60年代初，金其榮等人進行了檸檬酸發(fā)酵的菌種研究。上海工業(yè)微生物研究所，從土壤中經(jīng)酸性平板分離獲得的野生黑曲霉628作為出發(fā)菌株，經(jīng)多次60CO-Y射線和硫酸二乙脂等復合誘變，獲得了高產(chǎn)檸檬酸菌株Co827。它可直接利用薯干粉發(fā)酵，產(chǎn)酸達12 13%，平均轉化率為95%，發(fā)酵周期54 64h。無錫工業(yè)大學以黑曲霉H-142為出發(fā)菌株，通過Y射線、硫酸二乙脂、高溫單獨或復合誘變處理，通過高溫、高酸及高滲培養(yǎng)條件的定向篩選獲得HQL-601菌種。它的發(fā)酵溫度為40 41°C，周期60 64h，20%薯干粉搖瓶產(chǎn)酸13%，其檸檬酸純度明顯優(yōu)于現(xiàn)有發(fā)酵菌。郝捷應用低能離子注入誘變育種技術，對現(xiàn)有檸檬酸發(fā)酵菌進行改良，并改進了產(chǎn)檸檬酸高產(chǎn)菌的初篩方法。經(jīng)過多次N+注入，在實驗室選育獲得了 2株遺傳穩(wěn)定的玉米原料發(fā)酵生產(chǎn)檸檬酸的高產(chǎn)菌株，其中HN-2004搖瓶發(fā)酵96h，平均產(chǎn)酸13.8%。盡管HN-2004的產(chǎn)酸比原始出發(fā)菌株提高了 50%，但仍存在發(fā)酵周期長、糖酸轉化率低的問題。由此可見，使用單一的誘變因子往往很難達到預期的目的。王軍等在黑曲霉的育種中，首次嘗試了應用兩種核技術手段同時對黑曲霉進行誘變，并證實了采用60Co-Y輻照并復合N+注入方法的可行性，獲得了 I株發(fā)酵周期72h、產(chǎn)酸13.68%、轉化率達103.45%的M3代菌株CN05。離子注入是材料表面處理的通用技術，目前，運用離子注入進行作物品種改良已獲得了成功，目前可大致將離子注入分為能量沉積、動量傳遞、粒子注入和電荷交換等四個反應過程。其作用機制較為復雜，很難用單一模式解釋清楚。荷能離子注入除具有能量沉積引起機體損傷的特征外，還具有動能交換產(chǎn)生的級聯(lián)損傷，表現(xiàn)為遺傳物質原子轉移、重排或基因的缺失，還有慢化離子、移位原子和本底元素復合反應造成的化學損傷以及電荷交換引起的生物分子電子轉移造成的損傷。從離子注入的致死率曲線等可以看出，這種誘變手段在機理上有別于傳統(tǒng)方法。低能離子注入具有生理損傷小、突變率高等特點，能取得較高的正突變率。因此可將其用于動物和微生物的品種改良目前，檸檬酸發(fā)酵菌黑曲霉已經(jīng)歷了半個多世紀的誘變篩選，用于工業(yè)化生產(chǎn)檸檬酸的黑曲霉菌種大都經(jīng)過物理和化學誘變劑的處理，不同程度地增加了黑曲霉對一些誘變劑的抗性，若再使用同樣的方法則很難對現(xiàn)有菌種進行改良。對常用的物理和化學誘變劑產(chǎn)生了一定的抗性，因此如何采用更為先進的技術手段實現(xiàn)對檸檬酸產(chǎn)生菌黑曲霉的誘變育種成為現(xiàn)在亟待解決的問題。
技術實現(xiàn)思路
本專利技術針對現(xiàn)有檸檬酸產(chǎn)生菌黑曲霉的誘變育種遇到的技術瓶頸，提供了一種采用航天誘變手段獲得的黑曲霉孢子，通過耐受高糖高酸的定向篩選，設計出高效的科學篩選方案從而實現(xiàn)誘變選育獲得高產(chǎn)菌株，該菌株命名為TN-A09，專利技術人對其進行了生物保藏，其保藏號為CGMCC N0.5751，該菌株是耐高糖高酸、產(chǎn)酸高、轉化率高的檸檬酸生產(chǎn)菌株，利用其發(fā)酵生產(chǎn)檸檬酸，平均產(chǎn)酸達到18%，發(fā)酵周期60小時，轉化率99%，遠高于現(xiàn)有黑曲霉液體發(fā)酵檸檬酸技術水平。 本專利技術所采用的生產(chǎn)菌株，是將黑曲霉孢子搭載返回式航天器進行太空誘變后，經(jīng)過耐高糖高酸的定向篩選獲得的，專利技術人對其進行了生物保藏，保藏單位為中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，其保藏號為CGMCCN0.5751，其狀態(tài)為存活。本專利技術首次以搭載返回式航天器進行太空誘變的方法用于檸檬酸產(chǎn)生菌黑曲霉的誘變育種。不但可以避免黑曲霉對一些誘變劑的抗性，而且有較大的選擇空間，更容易得到較為優(yōu)良的菌種。在獲得上述菌種后，菌株的篩選是菌種誘變后的關聯(lián)步驟，也是決定優(yōu)良菌株選育效率的關鍵步驟。微生物細胞群體經(jīng)過誘變處理后，突變發(fā)生的頻率雖比自發(fā)突變的頻率高的多，但是在整個細胞的群體中，其頻率仍很低，即發(fā)生變異的細胞絕對數(shù)很低。DNA鏈上突變的發(fā)生是隨機的，所需要的突變株出現(xiàn)的頻率就更低，尋找所需的突變型猶如大海撈針。因此合理的篩選程序與方法在黑曲霉菌種的選育上非常重要。誘變是隨機的，但選擇是定向的。誘變后需通過正確、靈敏、快速的篩選檢測方法，從大量未變和負變的群體中把仍然是很少量的正向突變挑選出來。現(xiàn)有黑曲霉的誘變選育中，人們常以溴甲酚綠指示性平皿培養(yǎng)基上黃色指示圈的大小作為初篩依據(jù)，進行大規(guī)模淘汰，以提高篩選效率，但在實際應用中發(fā)現(xiàn)，溴甲酚綠明顯影響黑曲霉的生長和產(chǎn)酸，不能客觀的反映菌株的產(chǎn)酸性能。因此，為了以最少的工作量，在最短的時間內(nèi)取得最大的篩選效果，本專利技術的專利技術人設計高效的科學篩選方案從而實現(xiàn)誘變選育獲得聞廣菌株的目標。最終獲得耐聞糖聞酸且廣酸聞、轉化率聞、能耗低、生產(chǎn)成本低的檸檬酸菌種，具有重要的實際生產(chǎn)價值。本專利技術的具體技術方案是:一、航天誘變黑曲霉干孢子的準備1、將黑曲霉Co827接種于PDA(馬鈴薯培養(yǎng)基)斜面，在35°C條件下靜止培養(yǎng)4天，斜面長滿孢子后用無菌水沖洗孢子至帶玻璃珠的無菌三角瓶中，每支斜面洗到一只三角瓶中，用紗布包扎；2、將盛有孢子懸液的三角瓶放搖床上振蕩2小時，轉速270r/min，溫度25°C，充分打散孢子；3、將滅過菌的真空抽濾瓶放超凈工本文檔來自技高網(wǎng)...

【技術保護點】
一株檸檬酸高產(chǎn)菌株，其特征在于：該菌株命名為TN?A09，其保藏號為CGMCC?No.5751。

【技術特征摘要】
...

【專利技術屬性】
技術研發(fā)人員：王德培，寇光智，李昌濤，周一江，劉劍雄，高曉彤，
申請(專利權)人：日照魯信金禾生化有限公司，天津科技大學，
類型：發(fā)明
國別省市：