本發明專利技術涉及基因表達領域，特別涉及高效表達的豬白細胞介素-2基因，核苷酸序列見序列2。序列2的基因克隆至真核表達載體獲得的重組質粒。豬白細胞介素-2基因的表達蛋白對豬繁殖與呼吸綜合征滅活疫苗具有明顯的免疫增強作用。含有序列表中序列2的真核質粒pMVAX1?-pIL-2表達pIL-2蛋白基因，突破了通過pVAX1?載體表達pIL-2過程中遇到的表達量較低和活性較差的局限性，表達量提高了5.7倍；豬體試驗證明，序列表中序列2基因的表達蛋白pIL-2表達活性很高，能夠顯著增強高致病性PRRSV滅活疫苗的體液免疫和細胞免疫應答，專用于對高致病性PRRSV引起的疾病的預防及減少豬場的經濟損失。
【技術實現步驟摘要】
本專利技術涉及生物技術中基因表達領域，特別涉及一種高效表達的豬白細胞介素-2基因，還涉及其表達蛋白的用途。
技術介紹
豬繁殖與呼吸綜合征(Porcinereproductive and respiratory syndrome,PRRS),俗稱〃豬藍耳病〃，由豬繁殖與呼吸綜合征病毒(Porcine reproductive andrespiratory syndrome virus, PRRSV)引起,病毒感染后可以導致母豬流產、返情、產死胎或弱仔、仔豬死亡及各種年齡的豬不同程度的呼吸道癥狀，并且能破壞豬的免疫系統，引起混合感染或繼發感染。我國于1995年底爆發此病，并迅速蔓延到全國多個省份。在許多規模化豬場，PRRS陽性率很高，有的可達80%以上。自2006年以來，我國部分地區豬場發生了由PRRSV變異株導致的高致病性藍耳病。該病在臨床上以發病豬高熱、呼吸困難、皮膚發紅為主要特征，具有更高的發病率和死亡率，給我國的養豬業造成了極為嚴重的經濟損失。該病目前有滅活苗使用，但是免疫效果不盡理想。IL-2是由T淋巴細胞產生的一類Thl型細胞因子，又稱T細胞生長因子。能夠有效地提高機體的免疫功能，促進T、B淋巴細胞的增殖，增強NK細胞、單核巨噬細胞等的殺傷活性。IL-2是機體免疫應答的核心物質，不僅可作為抗病毒、抗腫瘤方面的治療藥劑，而且還可作為佐劑增強疫苗的免疫效果，具有廣闊的應用前景。1983年Taniguchi等首次克隆成功人的IL-2基因。1991年Goodall等首次克隆了豬IL-2基因(pIL-2)，隨后國內外學者用大腸桿菌、酵母、腺病毒等表達了 pIL-2，對其生物學活性進行了大量研究。本課題組也曾將pIL-2克隆入真核表達載體pVAXl°，轉染HEK-293A細胞后pIL-2的表達量和活性較低。
技術實現思路
為了解決以上豬繁殖與呼吸綜合征滅活苗免疫效果不理想、豬白細胞介素-2基因轉染后PIL-2的表達量和活性低的問題，本專利技術提供了一種高效表達的豬白細胞介素-2基因。本專利技術還提供了將上述序列2的基因通過分子生物學技術克隆至真核表達載體獲得的重組質粒。本專利技術還提供了上述豬白細胞介素-2基因的表達蛋白在增強高致病性PRRSV滅活疫苗體液免疫和細胞免疫應答中的應用。本專利技術是通過以下措施實現的: 一種聞效表達的豬白細胞介素_2基因，其核昔酸序列如序列表中序列2所不。一種序列2的基因通過分子生物學技術克隆至真核表達載體獲得的重組質粒。 一種所述的豬白細胞介素-2基因的合成方法，包括以下步驟 1、將真核質粒pVAXf改造為pMVAX廣:由 GenBank 公布的 Rabbit β -Globin Intron II 基因序列 GenBank No: V00882,在上游引入AiI酶切位點和pCMV即刻早期啟動子的一段序列，在下游引入T7啟動子序列和&oRI酶切位點，人工拼接后的核苷酸序列如序列表中序列I所示,將此段基因序列通過5^1/^boRI酶切位點插入pVAXf載體中，轉化感受態細菌，提取質粒經篩選得到SstV雙酶切陽性克隆，命名為PMVAXle ； 所述 pCMV 即刻早期啟動子的一段序列為:5’ -GTTTAGTGAACCGTCAGATCGCCTGGAGACGCCATCCACGCTGTTTTGACCTCCATAGAAGACACCGGGACCGATCCAGCCTCCGC-3，, 所述 17 啟動子序列為:5’ -AATACGACTCACTATAGGG-3’ ； 2、構建表達pIL-2的重組真核質粒pMVAXl°-pIL-2: 2.1設計一對擴增pIL-2蛋白的基因序列的特異性引物，引物序列如下: pIL-2-Fwd:5’ -TATGAATTCGGTACCACCATGGATAAGATGCAGC-3’， pIL-2-Rev:5’ -GAGCTCGAGAAGCTTAAGTCAGTGTTGAGTAGATGCTT-3’， 在上游引物pIL-2-Fwd的5’端引入&0RI限制性內切酶位點和Kozak序列，在下游引物pIL-2-Rev的5’端引入通ol限制性內切酶位點； 2.2從豬的脾淋巴細胞提取RNA，經反轉錄后得到cDNA，采用RT-PCR技術擴增出pIL_2蛋白基因的PCR產物； 2.3用feoRI/ZAoI雙酶切pMVAXf，膠回收得包含序列I的載體基因片段1，pIL-2蛋白基因的PCR產物經feoRI/ZAoI雙酶切并膠回收得到編碼pIL-2蛋白的基因片段2，將載體基因片段I和基因片段2連接，轉化感受態細菌，培養，挑取菌落于卡那霉素抗性的培養基中培養，提取質粒，進行feoRI/ZAoI雙酶切鑒定，篩選出陽性克隆，得pMVAXl°-pIL-2，相比較于真核質粒pVAXl°，pMVAXl°-pIL-2中插入的基因核苷酸序列如序列表中序列2所示。步驟2.2 中 PCR 反應體系為 25μ ，含 cDNA lPL，Mg2+ 1.5mmol/L,dNTP 200Mmol/L,IOXLA PCR Buffer 2.5μ ，pIL-2-Fwd 和 pIL-2-Rev 濃度均為 400nmol/L，TaKaRa LA Taq2U;反應條件為:預變性95° C 5min，然后進行35個循環，循環條件為95° C45s，61° C45s, 72° C Imin ;然后72° C延伸lOmin，取出產物進行1%的瓊脂糖凝膠電泳。一種所述的豬白細胞介素-2基因的表達蛋白在增強高致病性PRRSV滅活疫苗體液免疫和細胞免疫應答中的應用。本專利技術的有益效果是: (1)含有序列表中序列2的真核質粒pMVAXl°-pIL-2表達pIL_2蛋白基因，突破了通過pVAXl°載體表達pIL-2過程中遇到的表達量較低和活性較差的局限性，表達量提高了 5.7倍; (2)豬體試驗證明，序列表中序列2基因的表達蛋白pIL-2表達活性很高，能夠顯著增強高致病性PRRSV滅活疫苗的體液免疫和細胞免疫應答，專用于對高致病性PRRSV引起的疾病的預防及減少豬場的經濟損失。附圖說明 圖1為改造真核質粒pVA Xl°為pMVAXl°及克隆pIL-2蛋白基因入pMVAXl°的示意圖； 圖2為重組質粒pMVAXfAtVEco^l雙酶切鑒定圖譜，其中 M 為 DL2, 000 DNA Marker, I為重組陽性質粒ρΜνΑΧΓ的5^1/^boRI雙酶切結果；圖3為重組質粒pMVAXl°-pIL-2的&0RI/ZA0I雙酶切鑒定圖譜，其中 M 為 DL2, OOO DNA Marker, I和2為兩個不同重組陽性質粒pMVAXf-pIL-2的&0RI/ZA0I雙酶切結果； 圖4為重組質粒pMVAXf-pIL-2表達的pIL_2的Western_blot檢測，其中 泳道I為空載體質粒PVAXf轉染HEK-293A后Western-blot檢測條帶， 泳道2為改造的空載體質粒pMVAXf轉染HEK-293A后Western-blot檢測條帶， 泳道 3 為 pVAXf-pIL-2 轉染 HEK-293A 后 Western-blot 檢測條帶， 泳道 4 為 pMVAXf-p本文檔來自技高網...
【技術保護點】
一種高效表達的豬白細胞介素?2基因，其核苷酸序列如序列表中序列2所示。
【技術特征摘要】
【專利技術屬性】
技術研發人員：杜以軍，齊靜，王金寶，吳家強，黃保華，孫文博，叢曉燕，郭立輝，任素芳，陳蕾，李俊，時建立，呂偉，
申請(專利權)人：山東省農業科學院畜牧獸醫研究所，
類型：發明
國別省市：
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