本發明專利技術公開了一種特異性檢測轉基因番茄品系華番1號的標準分子及其應用。本發明專利技術所提供的標準分子為環狀載體，包括如序列1的第1-87位所示的乙烯形成酶反義基因片段、如序列1的第94-185位所示的番茄內源基因Lat52片段，以及如序列1的第192-299位所示的Ti質粒T-DNA的邊界序列片段。實驗證明，本發明專利技術所提供的標準分子具有較高的靈敏度，其最低檢測線可達2拷貝，線性范圍廣，均勻性好，穩定性強，對于轉基因番茄品系華番1號的定性和定量檢測具有重要意義。
【技術實現步驟摘要】
本專利技術涉及一種特異性檢測轉基因番茄品系華番I號的標準分子及其應用。
技術介紹
近年來，轉基因技術廣泛應用在農業生產中。華番I號就是利用轉基因技術將乙烯形成酶(EFE)反義基因導入到番茄中獲得耐貯藏的番茄品系，進一步與另一番茄品系(A53)雜交而獲得的。從1996 2001年，華番一號番茄已在湖北、廣西、貴州、新疆、江蘇等21個省市大面積推廣應用，累計推廣面積25余萬畝，累計新增利潤3.75億元，新增稅收7499.4 萬元。在轉基因檢測時，必須使用標準物質作為陽性對照或制作標準曲線，以對轉基因產品進行準確檢測。標準質粒分子是近幾年發展起來的一種可替代植物基因組的一種重組質粒分子，一般包括物種特異性片段和轉基因作物檢測的外源基因或品系特異性片段。優點是生產成本低，質粒DNA的純度高，產量大，制作和應用更為靈活，可以人為設計攜帶多個外源基因，使其應用更為廣泛。目前，已經成功應用于轉基因大豆棉花和玉米等的定量檢測，而且目前標準質粒分子已經獲得了國際協同認證。目前尚未有針對轉基因番茄品系華番I號進行特異性檢測的質粒標準分子的相關報道。
技術實現思路
本專利技術的目的是提供一種特異性檢測轉基因番茄品系華番I號的標準分子及其應用。本專利技術所提供的特異性檢測轉基因番茄品系華番I號的標準分子具體為環狀載體。所述環狀載體具體包括乙烯形成酶反義基因(ant1-EFE基因)片段、番茄內源基因Lat52片段，以及Ti質粒T-DNA的邊界序列(如右邊界序列RB)片段。在本專利技術中，所述乙烯形成酶反義基因片段的序列具體可如序列表中序列I的第1-87位所示；所述番茄內源基因Lat52片段的序列具體可如序列表中序列I的第94-185位所示；所述Ti質粒T-DNA的邊界序列片段的序列具體可如序列表中序列I的第192-299位所示。進一步，所述環狀載體為將所述乙烯形成酶反義基因片段、所述番茄內源基因Lat52片段、所述Ti質粒T-DNA的邊界序列片段一同與pEASY_T3質粒相連后得到的重組載體。更加具體的，所述環狀載體為將如序列表中序列I所示的DNA片段與所述PEASY-T3質粒連接所得的重組載體。所述環狀載體在作為標準分子檢測轉基因番茄品系華番I號中的應用也屬于本專利技術的保護范圍。本專利技術的另一個目的是提供一種定性或定量檢測轉基因番茄品系華番I號的試劑盒。本專利技術所提供的試劑盒，具體包括所述環狀載體和如下(al)_ (a3)中的全部或部分:(al)由序列表中序列2和序列3所示單鏈DNA組成的引物對，以及核苷酸序列如序列表中序列4所示的探針；(用于擴增ant1-EFE基因片段)(a2)由序列表中序列5和序列6所示單鏈DNA組成的引物對，以及核苷酸序列如序列表中序列7所示的探針；(用于擴增番茄內源基因Lat52片段)(a3)由序列表中序列8和序列9所示單鏈DNA組成的引物對，以及核苷酸序列如序列表中序列10所示的探針。(用于擴增RB片段)以上(al)- (a3)中，所述探針可為TaqMan熒光探針。TaqMan熒光探針是一種寡核苷酸探針，報告熒光基團連接在探針的5’末端，淬滅熒光基團連接在探針的3’末端。PCR擴增時在加入一對引物的同時加入一個特異性的熒光探針，探針完整時，報告基團發射的熒光信號被淬滅基團吸收； 0 擴增時3&(1酶的5’-3’外切酶活性將探針酶切降解，使報告熒光基團和淬滅熒光基團分離，從而熒光監測系統可接收到熒光信號，即每擴增一條DNA鏈，就有一個熒光分子形成，實現了熒光信號的累積與PCR產物形成完全同步。所述報告熒光基團可為Fam (FAM)、Hex (HEX)、Tet (TET)、Joe (JOE)、Vic (VIC)、Fite(FITE)、Cy3 (CY3)或 Cy5 (CY5)。所述淬滅熒光基團可為 Tamra (TAMRA)、Rox (ROX)、Dabcy (DABCY) ,Bhql (BHQl)或Bhq2 (BHQ2)。在本專利技術中，所述探針5’端標記的報告熒光基團具體為FAM熒光基團，3’端 標記的淬滅熒光基團具體為TAMRA熒光基團。所述試劑盒在作為標準體系檢測轉基因番茄品系華番I號中的應用也屬于本專利技術的保護范圍。制備所述試劑盒的方法也屬于本專利技術的保護范圍。該方法具體可包括如下步驟:將所述試劑盒中的所述環狀載體、各引物對和各探針分別單獨包裝。本專利技術所提供的特異性檢測轉基因番茄品系華番I號的標準分子包含外源基因ant1-EFE、內參基因Lat52及邊界序列部分區段。實驗證明，本專利技術所提供的標準分子具有較高的靈敏度，其最低檢測線可達2拷貝，線性范圍廣，均勻性好，穩定性強，對于轉基因番茄品系華番I號的定性和定量檢測具有重要意義。附圖說明圖1為標準分子pEASY-HFl質粒陽性克隆的PCR篩選結果。其中，泳道M為DL2000DNA分子量標準；泳道I為陽性對照；泳道2_17為16個標準分子pEASY-HFl質?？寺?。圖2為標準分子pEASY-HFl的質粒構建圖。圖3為各引物和探針特異性檢測結果。其中，A為外源基因ant1-EFE的特異性檢測結果:I表示轉基因番茄品系華番I號(GM0+)，2表示非轉基因番茄品系Money maker(GM0-);B為內參基因Lat52的特異性檢測結果:1表示轉基因番茄品系華番I號(GM0+)，2表示非轉基因番茄品系Money maker (GM0-) ;C為邊界序列(品系特異性)的特異性檢測結果:1表示轉基因番茄品系華番I號(GM0+)。圖4為標準體系的靈敏度及標準曲線測定。其中，a為外源基因ant1-EFE的靈敏度及標準曲線測定山內參基因Lat52的靈敏度及標準曲線測定；c為邊界序列(品系特異性)的靈敏度及標準曲線測定。a-c中，A-H均表示所檢測的模板(標準分子pEASY-HFl)的用量，A為1.5X IO7拷貝，B為1.5X IO6拷貝，C為1.5X IO5拷貝，D為1.5X IO4拷貝，E為1.5X IO3拷貝，F為1.5X IO2拷貝，G為1.5X IO1拷貝，H為1.5X10°拷貝。a_c中，標準曲線的橫坐標均表示起始拷貝數的對數，縱坐標均表示Ct值，即每個反應管內的熒光信號到達設定的域值時所經歷的循環數。具體實施例方式下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規方法。下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業途徑得到。pEASY-T3載體:北京全式金生物技術有限公司，產品目錄號為CT301。轉基因番茄品系華番I號(GM0+):記載于“黃文勝，陳紅運，趙文軍，等.轉基因延熟番茄“華番一號”的品系特異性檢測方法.植物檢疫，2005，19(6):321-325” 一文中；公眾可從中國檢驗檢疫科學研究院獲得。非轉基因番爺品系Moneymaker (GM0-):記載于“劉晶，周樹峰,等.農桿菌介導的雙價基因抗鹽轉化番茄的研究.2005，38(8): 1636-1644” 一文中；公眾可從中國檢驗檢疫科學研究院獲得。轉基因水稻品系科豐6號:中國檢驗檢疫科學研究院；戎俊，宋志平，蘇軍，夏輝，王鋒，盧寶榮.Bt/CpTI轉基因稻及其非轉基因親本對照在間隔種植條件下的轉基因漂移.生物多樣性，2006, 14(4):309 - `314?？曝S6號由中國水稻研究所王本文檔來自技高網...
【技術保護點】
環狀載體，包括乙烯形成酶反義基因片段、番茄內源基因Lat52片段，以及Ti質粒T?DNA的邊界序列片段。
【技術特征摘要】
【專利技術屬性】
技術研發人員：黃新，任鶴，
申請(專利權)人：中國檢驗檢疫科學研究院，
類型：發明
國別省市：
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