本發明專利技術公開了豬流行性腹瀉S1蛋白融合基因及重組巨大芽孢桿菌和應用。本發明專利技術將豬流行性腹瀉病毒S糖蛋白的S1抗原位點和細胞壁錨定序列連接得到SEQ?ID?No.1所示的抗原融合基因。本發明專利技術進一步的構建了含有該抗原融合基因的分泌表達載體，將其轉化到巨大芽孢桿菌中在其細胞壁或其表面表達重組蛋白。免疫印跡試驗表明，所表達的重組蛋白能夠與PEDV免疫血清發生反應，表明本發明專利技術所制備的重組蛋白與PEDV天然抗原一樣具有相同的抗原性。誘導表達后的活菌體免疫熒光試驗表明，所表達的重組蛋白定位于菌體的表面。實驗結果表明，本發明專利技術所制備的重組蛋白能夠用于制備成防治豬流行性腹瀉的安全、有效的粘膜免疫活菌疫苗。
【技術實現步驟摘要】
本專利技術涉及抗原融合基因以及含有該抗原融合基因的重組菌株，尤其涉及豬流行性腹瀉S1蛋白融合基因以及含有該融合基因的表達載體，本專利技術進一步涉及含有該表達載體的重組巨大芽孢桿菌菌株以及它們在制備防治豬流行性腹瀉疫苗中的應用，屬于豬流行性腹瀉的防治領域。
技術介紹
豬流行性腹瀉(PEDV)是由冠狀病毒引起豬的一種急性高度接觸性傳染病，以水瀉、嘔吐和脫水為特征，該病在世界范圍內廣泛分布，危害嚴重，給養豬業帶來重大經濟損失。病毒主要通過腸道感染豬，具有明顯的腸道組織嗜性的特點，在抗PEDV感染免疫過程中除體液免疫和細胞免疫外，局部腸粘膜免疫系統發揮著不可替代的作用。PEDV具有典型的冠狀病毒結構，由4種主要結構蛋白組成，分別為磷酸化的核衣殼蛋白(N)、膜蛋白(M)、糖基化的纖突蛋白(S)和小囊膜蛋白(E)其中S糖蛋白攜帶主要的B淋巴細胞抗原決定簇能夠誘導產生中和抗體和提供免疫保護作用的重要結構蛋白，因此，S蛋白對病毒感染、發揮其致病性和決定宿主細胞親嗜性方面起關鍵作用。PEDV感染具有明顯的嗜腸性，分泌型IgA抗體是保護豬體不受PEDV感染和免于發病的關鍵因素，口服免疫后，在腸液和血清中均可檢出slgA抗體，而非口服途徑接種則檢測不到slgA。仔豬可通過初乳獲得母源slgA，產生對流行性腹瀉的被動免疫保護。常規的滅活疫苗和弱毒疫苗在防治這兩種疾病中起到了積極作用，取得良好的效果，但是仍然存在一些問題，如滅活疫苗免疫原性差，不能有效誘導slgA，抵抗感染；弱毒疫苗接種后的動物機體排散病毒、病毒毒力可能返強等，另外必須通過注射途徑免疫。針對豬流行性腹瀉的特點，采用口服免疫是較為理想的預防途徑，但是如何避免胃腸道對抗原的破壞并有效誘導免疫應答成為關鍵。
技術實現思路
本專利技術的目的之一是提供一種豬流行性腹瀉S1蛋白抗原融合基因及其編碼的蛋白；本專利技術的目的之二是提供含有上述豬流行性腹瀉S1蛋白抗原融合基因的表達載體；本專利技術的目的之三提供含有上述表達載體的重組宿主菌株。為了實現上述目的，本專利技術一方面提供了一種由PEDV糖蛋白S的S1抗原位點與化膿鏈球菌細胞壁錨定序列(CWAm6)連接得到的融合基因，其多核苷酸序列為SEQID N0.1所示。本專利技術根據Genbank登錄的PEDV全基因序列AF353511，找出編碼S糖蛋白的22-505aa段序列，通過柔性的Linker ((GGGGS) 3)將PEDV的S1抗原位點基因和細胞壁錨定序列(CWAm6)連接起來，將該序列命名為MLS1 (SEQ ID N0.1)。考慮到巨大芽孢桿菌密碼子的偏嗜情況，本專利技術為了提高異源基因在宿主菌中的表達，并保證翻譯后的氨基酸不變的情況下，對稀有密碼子蘇氨酸(ACG)、組氨酸(CAC)、精氨酸(CGG、CGA)、丙氨酸(GCG)和亮氨酸(CTC、CTG)等進行改變。此外，在MLS1的上游和下游分別引入Bgl II酶切位點和SphI酶切位點。本專利技術的另一方面是提供由SEQ ID N0.1所示融合基因編碼的蛋白，其氨基酸序列為SEQ ID N0.2所示。。本專利技術的又一方面是提供含有所述豬流行性腹瀉S1蛋白融合基因的表達載體；例如，將本專利技術SEQ ID N0.1所示的抗原融合基因與表達載體PHIS1525進行可操作性的連接，得到可以在巨大芽孢桿菌的外表面或其細胞壁表達融合基因的分泌表達載體。針對PEDV經黏膜感染和slgA在抵抗疾病中具有重要作用的特點，本專利技術構建了表達PEDV S1蛋白的重組巨大芽孢桿菌表達系統，作為一種口服疫苗，通過刺激腸道黏膜免疫系統產生的特異性slgA，達到阻止病原感染的目的。由此，本專利技術的再一方面是提供一株表達豬流行性腹瀉SI蛋白融合基因的重組巨大芽孢桿菌菌株，能夠用其制備成防治豬流行性腹瀉的安全、有效的粘膜免疫活菌疫苗。本專利技術將SEQ ID N0.1所示的融合基因與分泌表達載體pHIS1525進行雙酶切、連接并經原生質體轉化轉入宿主菌巨大芽孢桿菌WH320細胞，獲得含有重組質粒的重組巨大芽孢桿菌(Bacillus megaterium)菌株(WH320-PHIS1525-MLSJ ;其微生物保藏號是:CCTCC No:M2011445 ;分類命名是:巨大芽孢桿菌 WHSZO-pHISlSZS-MLSi (Bacillusmegaterium WH320-PHIS1525-MLSD ;保藏時間是2011年12月5日；保藏單位是:中國典型培養物保藏中心；保藏地址是:中國武漢武漢大學。進一步的，本專利技術將重組巨大芽孢桿菌菌株(WH320-PHIS1525-MLSJ用加入終濃度為0.2%木糖進行誘導，使融合基因在菌體表面進行表達；免疫印跡實驗表明，所表達的重組蛋白能夠與TGEV免疫血清發生反應，表明重組蛋白與TGEV天然抗原一樣具有相同的抗原性，能夠用于制備成防治豬流行性腹瀉的安全、有效的粘膜免疫活菌疫苗。間接免疫熒光檢測也證實表達蛋白存在于菌體上，誘導表達后的活菌體免疫突光試驗表明，所表達的蛋白初步定位于菌體的表面，存在菌體表面的目的蛋白，為抗原物質有效刺激免疫系統，提高抗體水平奠定了重要的物質基礎。本專利技術在實驗設計上以阻斷腸道傳染病疾病病原感染的第一道防線為目的，使用安全無毒的巨大芽孢桿菌表達系統，巨大芽孢桿菌不產細胞內毒素，不產胞外堿性蛋白酶，有利于所表達蛋白的穩定積累，質粒穩定，可以穩定高效地表達蛋白，比較適合工業化發酵生產。同時芽孢桿菌在腸道定植后，能消耗大量的游離氧，造成厭氧環境，可減少需氧菌對腸道的定植。也有利于乳酸桿菌和雙歧桿菌等厭氧菌的生長，致使體內的有益菌增加而致病菌減少，保持腸道微生態系統平衡。為了檢驗本專利技術重組巨大芽孢桿菌或該重組巨大芽孢桿菌所表達的融合蛋白MLSJt為防治豬傳染性胃腸炎口服疫苗的可行性，本專利技術將構建的重組巨大芽孢桿菌WH320-PHIS1525-MLS! 口服免疫小鼠，不同時間測定腸道糞便中特異性抗體slgA的水平；試驗結果發現，重組巨大芽孢桿菌ΙΗ320-ρΗΙ31525-ΜΙΑ在連續3次免疫后誘導小鼠產生了明顯的抗PEDV-S蛋白的分泌性slgA抗體反應。重組菌組后期采樣抗體一直上升，各時間點采樣抗體水平均明顯高于免疫之初及對照菌(免疫空載體轉化菌WH320-pHIS1525)組和PBS組(p〈0.05)，重組菌組38d時抗體水平達到頂峰(p〈0.05)，之后下降，至60d時抗體水平仍明顯高于對照組(P〈0.05)。試驗結果表明，本專利技術所構建的重組巨大芽孢桿菌或所表達的融合蛋白MLS1能有效的刺激小鼠腸道免疫系統產生特異性免疫應答，能將其制備成防治豬傳染性胃腸炎的口服疫苗。本專利技術所涉及到的術語定義除非另外定義，否則本文所用的所有技術及科學術語都具有與本專利技術所屬領域的普通技術人員通常所了解相同的含義。雖然在本專利技術的實踐或測試中可使用與本文所述者類似或等效的任何方法、裝置和材料，但現在描述優選方法、裝置和材料。術語“重組宿主菌株”或“宿主細胞”意指包含本專利技術多核苷酸的細胞，而不管使用何種方法進行插入以產生重組宿主細胞，例如直接攝取、轉導、f配對或所屬領域中已知的其它方法。外源性多核苷酸可保持為例如質粒的非整合載體或者可整合入宿主基因組中。術語“多核苷酸”意指單股或雙股形式的脫氧核糖核本文檔來自技高網...
【技術保護點】
豬流行性腹瀉S1蛋白抗原融合基因，其特征在于：其多核苷酸序列為SEQ?IDNo.1所示。
【技術特征摘要】
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【專利技術屬性】
技術研發人員：張金林，馬立保，胡曉芬，
申請(專利權)人：武漢華揚動物藥業有限責任公司，
類型：發明
國別省市：
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