豬傳染性胃腸炎S/N蛋白融合基因及重組乳酸乳球菌和應(yīng)用制造技術(shù)

本發(fā)明專利技術(shù)公開了豬傳染性胃腸炎S/N蛋白融合基因及重組乳酸乳球菌和應(yīng)用。本發(fā)明專利技術(shù)提供了由豬傳染性胃腸炎病毒S蛋白中A、D抗原位點和N蛋白中的N321抗原位點與化膿鏈球菌細(xì)胞壁錨定序列連接一起后得到的融合基因，其核苷酸序列為SEQ?ID?No.1所示。本發(fā)明專利技術(shù)進(jìn)一步提供了含有該融合基因的表達(dá)載體及含有該重組表達(dá)載體的重組乳酸乳球菌菌株。將重組乳酸乳球菌菌株用乳鏈桿菌肽Nisin進(jìn)行誘導(dǎo)，融合基因可在細(xì)菌細(xì)胞壁表面進(jìn)行表達(dá)。免疫印跡實驗表明，所表達(dá)的重組蛋白能夠與TGEV免疫血清發(fā)生反應(yīng)，表明重組蛋白與TGEV天然抗原一樣具有相同的抗原性，可將其制備成防治豬傳染性胃腸炎的安全、有效的粘膜免疫活菌疫苗。

【技術(shù)實現(xiàn)步驟摘要】

本專利技術(shù)涉及抗原融合基因以及含有該抗原融合基因的重組菌株，尤其涉及豬傳染性胃腸炎病毒S/N蛋白融合基因以及含有該融合基因的表達(dá)載體，本專利技術(shù)進(jìn)一步涉及含有該表達(dá)載體的重組乳酸乳球菌(Lactococcuslactis)菌株以及它們在制備防治豬傳染性胃腸炎疫苗中的用途，屬于豬傳染性胃腸炎的防治領(lǐng)域。
技術(shù)介紹
豬傳染性胃腸炎是由傳染性胃腸炎病毒(Transmissible gastroenteritisvirusof swine, TGEV)所引起的以嚴(yán)重腹瀉、嘔吐、脫水和高死亡率為主要特征的高度接觸性傳染病。TGEV主要存在于空腸和十二指腸，各種日齡的豬均易感。由于仔豬自身抵抗力比較差，易受外界各種刺激因素的影響和病原微生物的侵襲，常會因嚴(yán)重脫水而發(fā)生死亡，并以2周齡以內(nèi)的仔豬死亡率 最高，可達(dá)100%。隨日齡的增大，雖然死亡率逐漸下降，但感染該病的豬生產(chǎn)性能下降，飼料報酬率低，給世界范圍內(nèi)的養(yǎng)豬業(yè)都帶來嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。豬傳染性胃腸炎病毒主要通過腸道感染豬，具有明顯的腸道組織嗜性的特點，在抗TGEV感染免疫過程中除體液免疫和細(xì)胞免疫外，局部腸粘膜免疫系統(tǒng)發(fā)揮著不可替代的作用。常規(guī)的滅活疫苗和弱毒疫苗在防治這兩種疾病中起到了積極作用，取得良好的效果，但是仍然存在一些問題，如滅活疫苗免疫原性差，不能有效誘導(dǎo)slgA，抵抗感染；弱毒疫苗接種后的動物機(jī)體排散病毒、病毒毒力可能返強(qiáng)等，另外必須通過注射途徑免疫。針對本病的特點，采用口服免疫是較為理想的預(yù)防途徑，但是如何避免胃腸道對抗原的破壞并有效誘導(dǎo)免疫應(yīng)答成為技術(shù)的關(guān)鍵。TGEV有三種主要結(jié)構(gòu)蛋白，分別為磷酸化的核衣殼蛋白N、膜蛋白M和糖基化的纖突蛋白S，其中S糖蛋白攜帶主要的B淋巴細(xì)胞抗原決定族，并且可以介導(dǎo)細(xì)胞的吸附、中和抗體的產(chǎn)生等過程，可以提供有效的免疫保護(hù)作用。TGEV感染具有明顯的嗜腸性，病毒粒子表面的纖突蛋白(S蛋白)與存在于腸上皮細(xì)胞頂膜的氨基肽酶(APN)的結(jié)合是感染發(fā)生的首要條件，粘膜免疫是本病特異性免疫應(yīng)答的主要特征，腸道粘膜表面SIgA含量的高低直接決定臨床疾病的發(fā)生和疾病嚴(yán)重程度。針對豬傳染性胃腸炎發(fā)病的幾個特點，采用口服免疫是較為理想的預(yù)防途徑?？诜庖咄怀龅膬?yōu)點是可有效地刺激腸道局部免疫細(xì)胞產(chǎn)生分泌型IgA，這尤其適應(yīng)于腸道粘膜傳染病，但口服免疫需要克服免疫原在到達(dá)小腸粘膜之前被降解或滅活的可能。使用細(xì)菌病毒等活載體來傳遞完整無損的抗原成分解決了這個問題，目前有使用減毒細(xì)菌作為疫苗抗原的載體的報道，如沙門氏菌、弱毒李斯特菌等，但沙門氏菌作為載體傳遞DNA疫苗可能存在毒力返強(qiáng)的危險，質(zhì)粒DNA也可能會整合到宿主細(xì)胞基因組，引起調(diào)控細(xì)胞生長的基因紊亂、原癌基因和抑癌基因的表達(dá)失控、體細(xì)胞癌變、細(xì)胞轉(zhuǎn)型等一系列問題。
技術(shù)實現(xiàn)思路
本專利技術(shù)的目的之一是提供一種豬傳染性胃腸炎病毒S/N蛋白抗原融合基因及其編碼的蛋白；本專利技術(shù)的目的之二是提供含有上述豬傳染性胃腸炎病毒S/N蛋白抗原位點的融合基因的表達(dá)載體；本專利技術(shù)的目的之三提供含有上述表達(dá)載體的重組宿主菌株。為了實現(xiàn)上述目的，本專利技術(shù)一方面提供了一種由豬傳染性胃腸炎病毒S蛋白中A、D抗原位點和N蛋白中的N321抗原位點與化膿鏈球菌細(xì)胞壁錨定序列(CWAm6)連接得到的抗原融合基因，其多核苷酸序列為SEQ ID N0.1所示。本專利技術(shù)將TGEV S蛋白中A、D抗原位點(Sad)和N蛋白中的N321抗原位點與化膿鏈球菌細(xì)胞壁錨定序列(CWAm6)(以化膿鏈球菌M6蛋白的最后140個氨基酸為細(xì)胞壁錨定序列)連接起來，考慮到乳酸乳球菌使用密碼子的偏嗜情況，為了提高異源基因在宿主菌中的表達(dá)，并保證翻譯后的氨基酸不變的情況下，對稀有密碼子絲氨酸(TCG)、蘇氨酸(ACG)、脯氨酸(CCC)、精氨酸(CGG)、苯丙氨酸(TTC)等進(jìn)行改變，但不改變其所編碼的氨基酸。對A抗原位點上的3個甲基化位點(AAC — AAT，ATC — ATT，ACA — ACT)進(jìn)行點突變，但不改變其所編碼的氨基酸。通過兩個柔性的Linker((GGGGS)3)將TGEV的A、D抗原位點基因和N32i抗原位點基因連接起來(順序為D-Linker-N321-Linker-A),并把該序列命名為MLSN (SEQIDN0.1);此外，在MLSN的上游和下游分別引入NcoI酶切位點和SacI酶切位點。本專利技術(shù)的另一方面是提供由SEQ ID N0.1所示抗原融合基因編碼的蛋白，其氨基酸序列為SEQ ID N0.2所示。。本專利技術(shù)的又一方面是提供含有所述抗原融合基因的表達(dá)載體，譬如，將本專利技術(shù)的SEQ ID N0.1所示的抗原融合基因與表達(dá)載體pNZ8149進(jìn)行連接，得到可以在乳酸乳球菌的外表面或細(xì)胞壁表達(dá)抗原融合基因 的分泌表達(dá)載體。由此，本專利技術(shù)的再一方面是提供一株表達(dá)豬傳染性胃腸炎病毒S/N蛋白的重組乳酸乳球菌菌株，能夠用其制備成防治豬傳染性胃腸炎的安全、有效的粘膜免疫活菌疫苗。本專利技術(shù)將SEQ ID N0.1所示融合基因與分泌表達(dá)載體pNZ8149進(jìn)行雙酶切、連接并經(jīng)電擊轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)入乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)NZ3900細(xì)胞，獲得含有重組質(zhì)粒的乳酸乳球菌命名為NZ3900-pNZ8149-MLSN ;其微生物保藏號是:CCTCC No:M2011444 ;分類命名是:乳酸乳球菌 NZ3900-pNZ8149-MLSN (Lactococcus lactis NZ3900_pNZ8149_MLSN);保藏時間是2011年12月5日；保藏單位是:中國典型培養(yǎng)物保藏中心；保藏地址是:中國武漢武漢大學(xué)。進(jìn)一步的，本專利技術(shù)將重組乳酸乳球菌菌NZ3900-PNZ8149-MLSN用乳鏈桿菌肽Nisin進(jìn)行誘導(dǎo)，使目的基因在菌體表面進(jìn)行表達(dá)；免疫印跡實驗表明，所表達(dá)的重組蛋白能夠與TGEV免疫血清發(fā)生反應(yīng)，表明重組蛋白與TGEV天然抗原一樣具有相同的抗原性，能夠用于制備成防治豬傳染性胃腸炎的安全、有效的粘膜免疫活菌疫苗。本專利技術(shù)構(gòu)建了 NZ3900-pNZ8149-MLSN表達(dá)載體系統(tǒng)，表達(dá)了含有TGEV蛋白A/D位點和N蛋白N321位點與化膿鏈球菌細(xì)胞壁錨定序列CWAM6連接序列MLSN (目的蛋白約28kDa);免疫印跡試驗表明，所表達(dá)的重組蛋白能夠與TGEV免疫血清發(fā)生反應(yīng)，表明重組蛋白與TGEV天然抗原一樣具有相同的抗原性。間接免疫熒光也證實表達(dá)蛋白存在于菌體上，誘導(dǎo)表達(dá)后的活菌體免疫熒光試驗表明，所表達(dá)的重組蛋白初步定位于菌體的表面，存在菌體表面的目的蛋白為抗原物質(zhì)有效刺激免疫系統(tǒng)，提高抗體水平奠定了重要的物質(zhì)基礎(chǔ)。本專利技術(shù)針對TGEV發(fā)生和免疫的幾個特點，在實驗設(shè)計上以阻斷腸道傳染病疾病病原感染的第一道防線為目的，利用安全無毒的乳酸菌表達(dá)系統(tǒng)在腸道黏膜上粘附、定植和表達(dá)及傳遞抗原物質(zhì)，因而抗原物質(zhì)對黏膜的免疫刺激作用更接近于病毒的自然感染途徑，因此所產(chǎn)生的黏膜免疫保護(hù)效果將更為理想。同時，乳酸菌本身具有佐劑效應(yīng)，會明顯加強(qiáng)抗原的免疫原性，機(jī)體對乳酸菌載體系統(tǒng)本身不產(chǎn)生強(qiáng)的抗體應(yīng)答反應(yīng)，乳酸菌還可合成一些生物活性物質(zhì)，如乳酸菌素、細(xì)菌素、多種有機(jī)酸等，這些物質(zhì)本身就具有抑菌抗菌、抗腹瀉作用。為了檢驗本專利技術(shù)所構(gòu)建的重組乳酸乳球菌或該本文檔來自技高網(wǎng)...

【技術(shù)保護(hù)點】
豬傳染性胃腸炎病毒（Transmissible?gastroenteritis?virus?of?swine）S/N蛋白抗原融合基因，其特征在于：其多核苷酸序列為SEQ?ID?No.1所示。

【技術(shù)特征摘要】
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【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：張金林，馬立保，胡曉芬，
申請(專利權(quán))人：武漢華揚(yáng)動物藥業(yè)有限責(zé)任公司，
類型：發(fā)明
國別省市：