一種豬偽狂犬病毒的高通量藥物篩選的方法技術(shù)

本發(fā)明專利技術(shù)公開了一種豬偽狂犬病毒的高通量藥物篩選的方法，其步驟：（1）在白色底透96孔細(xì)胞板中接種IBRS-2細(xì)胞，在37°C5%CO2溫箱中培養(yǎng)；（2）棄去生長液，加入維持液，加入待篩選化合物，依次進(jìn)行倍比稀釋，混合均勻，在每個孔中加入豬偽狂犬病毒鄂A株，在同一塊96孔板上，設(shè)置未加入病毒和化合物的對照、加入病毒未加化合物的對照，化合物溶解于二甲亞砜中；（3）在37°C5%CO2溫箱中繼續(xù)培養(yǎng)，加入Celltiterglo試劑，在高通量化學(xué)發(fā)光檢測儀中檢測，計算化合物的抑制率；（4）具有較高抑制率的化合物作為抗偽狂犬病毒的潛在藥物。方法簡便、快速、成本低、便于高通量操作，能夠針對豬偽狂犬病毒在細(xì)胞中增殖的全部過程進(jìn)行篩選，具有較高的成功率。

【技術(shù)實現(xiàn)步驟摘要】

本專利技術(shù)涉及動物傳染病防控和動物藥物篩選
更具體涉及，在藥物抑制豬偽狂犬病毒導(dǎo)致的細(xì)胞病變基礎(chǔ)上，通過測定細(xì)胞活力，建立的針對豬偽狂犬病毒的體外藥物篩選方法。
技術(shù)介紹
豬偽狂犬病(Pseudorabies,PR)是由偽狂犬病毒(Pseudorabies virus, PRV)所引起的一種以發(fā)熱、奇癢和腦脊髓炎為主要癥狀的急性、接觸性和高度致死性傳染病。該病能引起妊娠母豬流產(chǎn)、產(chǎn)死胎和木乃伊胎等，公豬表現(xiàn)睪丸炎、睪丸腫脹萎縮失去種用能力，仔豬表現(xiàn)高熱、呼吸困難、流涎、嘔吐、腹瀉、食欲廢絕以及抑郁震顫等癥狀，繼而出現(xiàn)間歇性抽搐、昏迷以致衰竭死亡。偽狂犬病是引起我國豬繁殖疾病的主要原因，在養(yǎng)豬密集的地方可爆發(fā)流行。2周齡以內(nèi)仔豬的發(fā)病率和死亡率幾乎高達(dá)100%，斷奶仔豬發(fā)病率為20% 40%，死亡率為10% 20%。成年豬感染后，常常繼發(fā)細(xì)菌和病毒感染，加重病程和增加死亡率。豬偽狂犬病已給我國的養(yǎng)豬業(yè)造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失，開發(fā)豬偽狂犬病的預(yù)防和治療產(chǎn)品具有重要的經(jīng)濟(jì)價值。當(dāng)前對于豬偽狂犬病的預(yù)防主要依賴于疫苗，且目前已成功開發(fā)并產(chǎn)業(yè)化了多種疫苗。用偽狂犬病毒強(qiáng)毒株經(jīng)滅活、乳化后制備的滅活疫苗具有安全、免疫期長的優(yōu)點(diǎn)，但免疫后對機(jī)體產(chǎn)生的刺激較大。經(jīng)異源細(xì)胞傳代致弱或基因工程改造致弱后，開發(fā)的偽狂犬病弱毒疫苗，具有免疫刺激小、免疫效果好的特點(diǎn)，但可能具有毒力返強(qiáng)的危險，近來有使用進(jìn)口偽狂犬病弱毒疫苗后豬群發(fā)病的報道。疫苗都需要一定的免疫期才能產(chǎn)生較好的免疫保護(hù)效果，而藥物使用后可迅速產(chǎn)生預(yù)防和治療效果。對于豬偽狂犬病毒藥物的研究在國內(nèi)外仍未有報道，也沒有可用的藥物用于該病的預(yù)防和治療。豬偽狂犬病毒 感染細(xì)胞后，可產(chǎn)生明顯的細(xì)胞病變效應(yīng)，病變細(xì)胞形態(tài)改變，活力降低，直至細(xì)胞死亡，與無病毒感染的細(xì)胞形成鮮明的對照，當(dāng)化合物對病毒增殖具有抑制活性時，病毒導(dǎo)致的細(xì)胞病變效應(yīng)下降，因此對病毒感染的細(xì)胞進(jìn)行活力測定，可評估偽狂犬病毒在細(xì)胞中的增殖狀況，進(jìn)而建立針對豬偽狂犬病毒的藥物高通量篩選方法。
技術(shù)實現(xiàn)思路
本專利技術(shù)的目的是在于提供了，該方法簡便、快速、成本低、便于高通量操作，能夠針對豬偽狂犬病毒在細(xì)胞中增殖的全部過程進(jìn)行篩選，具有較高的成功率。同時應(yīng)用該方法篩選到一種抗豬偽狂犬病毒的化合物BVDUji豬偽狂犬病毒強(qiáng)度株具有很好的抑制效果，且對豬偽狂犬病毒活疫苗毒株無抑制效果，是一種理想的抗偽狂犬病毒潛在藥物。本專利技術(shù)通過以下技術(shù)方案實現(xiàn):，其步驟是:(I)在白色底透96孔細(xì)胞板中接種IBRS-2細(xì)胞(豬腎細(xì)胞系，該細(xì)胞系在相關(guān)領(lǐng)域長期普遍)，細(xì)胞的接種密度為5000個/孔，在37° C 5%C02溫箱中培養(yǎng)10-14小時。(2)棄去生長液，在第一孔加入98yL維持液(DMEM中含有1%(ν/ν)牛血清和1%(ν/ν)雙抗)，其它孔加入50μ L維持液，再在第一孔加入2μ L待篩選化合物，依次進(jìn)行倍比稀釋，混合均勻后，在每個孔中均加入50 μ L 0.02Μ0Ι的豬偽狂犬病毒鄂A株。在同一塊96孔板上，設(shè)置未加入病毒和化合物的對照、加入病毒未加化合物的對照。由于化合物均是溶解于二甲亞砜(DMSO)中，因此在所有對照組中加入l%(v/v)DMS0。(3)在 37° C 5%C02 溫箱中繼續(xù)培養(yǎng) 46-50 小時后，加入 IOOyL Celltiter glo試劑(PiOme ga公司)，反應(yīng)9-11分鐘后，在高通量化學(xué)發(fā)光檢測儀中檢測，計算化合物的抑制率。(4)化合物抑制率％=(待篩化合物孔的化學(xué)發(fā)光值-病毒對照組化學(xué)發(fā)光值的平均值)/ (細(xì)胞對照組化學(xué)發(fā)光值的平均值-病毒對照組化學(xué)發(fā)光值的平均值)。對不同化合物的抑制率進(jìn)行計算，得到抑制率較高的化合物作為抗偽狂犬病毒的潛在藥物。本專利技術(shù)與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有以下優(yōu)點(diǎn)和效果:A.本專利技術(shù)中建立的豬偽狂犬病毒藥物高通量篩選技術(shù)具有準(zhǔn)確、直接、易于實現(xiàn)自動化的優(yōu)點(diǎn)，較傳統(tǒng)的MTT法更加準(zhǔn)確。同時本專利技術(shù)中的方法還可同時對化合物進(jìn)行倍比稀釋后，測定同一化合物不同濃度下的抗病毒活性，有效提高了命中率。B.本專利技術(shù)中篩選得到的化合物(E)_5_(2-Bromovinyl)_2’ -deoxyuridine (以下簡稱BVDU)對豬偽狂犬病毒藥物的抗病毒效果:通過抗病毒試驗測定BVDU對豬偽狂犬病毒抑制的半數(shù)有效濃度(EC50)低于1.56μΜ，半數(shù)細(xì)胞抑制濃度(CC50)為105.1 μ M，BVDU對豬偽狂犬病毒的選擇性指數(shù)(SI)大于100，可作為理想的抗豬偽狂犬病毒候選藥物。同時還發(fā)現(xiàn)BVDU對TK基因缺失的弱毒疫苗株的抑制率低于25%，因此BVDU使用后不會影響疫苗的免疫效果。 C.本專利技術(shù)中篩選得到的BVDU對偽狂犬病毒的抑制效果是廣譜抗病毒藥物利巴韋林的30倍，是皰疹病毒特效藥阿昔洛韋的62倍。附圖說明圖1為不同接種密度下細(xì)胞的生長曲線示意圖。圖中說明細(xì)胞在5000個/孔時，其生長與時間成正比。圖2為不同細(xì)胞接種密度下病毒感染后的細(xì)胞生長曲線示意圖。圖中說明細(xì)胞密度為5000個/孔時，接種病毒后，細(xì)胞活力與時間成反比。圖3為不同劑量的病毒感染后S/B值變化示意圖。S/B值為正常細(xì)胞中測定的化學(xué)發(fā)光值+接種病毒細(xì)胞中測定的化學(xué)發(fā)光值。圖中說明細(xì)胞密度在5000個/孔時，以0.01Μ0Ι接種病毒，S/B值大于10。圖4為DMSO對細(xì)胞活力的影響示意圖。DMSO濃度小于2%時，不影響細(xì)胞生長。圖5為用高通量篩選技術(shù)對48種化合物進(jìn)行篩選的示意圖。對48種化合物進(jìn)行復(fù)篩，其中6種的抑制率大于20%。圖6為BVDU對豬偽狂犬病毒野毒株和疫苗毒株的抑制效果示意圖。BVDU對豬偽狂犬病毒野毒的抑制率均>65%，而對TK基因缺失的疫苗株抑制率均〈20%。圖7為空斑減少試驗檢測BVDU對豬偽狂犬病毒的抑制效果示意圖。圖中Mock組為不加入任何化合物的對照組。BVDU濃度在1.56uM及以上時，可完全抑制偽狂犬病毒的生長。圖8為BVDU對細(xì)胞的抑制活性檢測示意圖。圖中說明BVDU濃度在IOOuM及以下時，不影響細(xì)胞的生長。圖9為BVDU結(jié)構(gòu)式示意圖。具體實施例方式實施例1:，其步驟是:(I)高通量篩選中最佳細(xì)胞接種密度和檢測終點(diǎn)的確定:為尋找到最佳的細(xì)胞接種密度，在96孔細(xì)胞培養(yǎng)板上接種IOOyL 5000cells/孔、7500cells/ 孔、lOOOOcells/ 孔、15000cells/ 孔和 20000cells/ 孔，并連續(xù)培養(yǎng)至 96h。培養(yǎng)期間每隔24h使用CellTiter glo檢測細(xì)胞活力。結(jié)果顯示細(xì)胞對照組統(tǒng)計結(jié)果顯示在72h內(nèi)細(xì)胞活力呈持續(xù)增長趨勢；72h到96h細(xì)胞活力開始下降，表明細(xì)胞在培養(yǎng)至96h后已過度生長出現(xiàn)死亡(附圖1)。病毒對照組相同條件下培養(yǎng)至96h，每隔24h相同方法檢測一次。檢測結(jié)果顯示24h到48h內(nèi)細(xì)胞活力呈持續(xù)上升趨勢；48h后隨著培養(yǎng)時間延長細(xì)胞病變逐漸明顯，細(xì)胞活力 下降(附圖2)。其中每孔接種5000cells培養(yǎng)至72h時S/B值為24.U因子為0.68、細(xì)胞CV值和病毒CV值分別為9.94%和10%，滿足高通量篩選要求。因此選擇每孔接種100 μ L 5000cells培養(yǎng)至72h作為檢測終點(diǎn)完成后續(xù)試驗。(2)本文檔來自技高網(wǎng)...

【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
一種豬偽狂犬病毒的高通量藥物篩選的方法，其步驟是：???（1）在白色底透96孔細(xì)胞板中接種IBRS?2細(xì)胞，細(xì)胞的接種密度為5000個/孔，在37°C?5%?CO2溫箱中培養(yǎng)10?14小時；???（2）棄去生長液，在第一孔加入98μL維持液：DMEM中含有1%v/v牛血清和1%v/v雙抗，其它孔加入50μL維持液，再在第一孔加入2μL待篩選化合物，依次進(jìn)行倍比稀釋，混合均勻后，在每個孔中均加入50μL?0.02MOI的豬偽狂犬病毒鄂A株，在同一塊96孔板上，設(shè)置未加入病毒和化合物的對照、加入病毒未加化合物的對照，化合物均是溶解于二甲亞砜中，在所有對照組中加入1%v/vDMSO；???（3）在37°C?5%?CO2溫箱中繼續(xù)培養(yǎng)46?50小時后，加入100μL?Celltiter?glo試劑，反應(yīng)9?11分鐘后，在高通量化學(xué)發(fā)光檢測儀中檢測，計算化合物的抑制率；???（4）化合物抑制率%=待篩化合物孔的化學(xué)發(fā)光值?病毒對照組化學(xué)發(fā)光值的平均/細(xì)胞對照組化學(xué)發(fā)光值的平均值?病毒對照組化學(xué)發(fā)光值的平均值，對不同化合物的抑制率進(jìn)行計算，得到抑制率的化合物作為抗偽狂犬病毒的潛在藥物。

【技術(shù)特征摘要】

【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：宋云峰，周銳，王翠，陳煥春，
申請(專利權(quán))人：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)，
類型：發(fā)明
國別省市：