本發(fā)明專利技術(shù)的目的是提供一種輔助鑒定煙草環(huán)斑病毒的試劑及其應(yīng)用。本發(fā)明專利技術(shù)提供的試劑包括由序列表的序列1所示DNA、序列表的序列2所示DNA和序列表的序列3所示DNA組成的特異引物。所述試劑還可包括核苷酸序列如序列表的序列4所示的特異探針。煙草環(huán)斑病毒是我國(guó)重要的檢疫性有害生物，本發(fā)明專利技術(shù)中利用三條巢式PCR引物和一條TaqMan探針，建立了半巢式-RT-Realtime?PCR檢測(cè)TRSV的方法。該方法有機(jī)地結(jié)合了巢式PCR和實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)；三條引物和一條探針形成的兩套PCR體系相互驗(yàn)證，有效提高了結(jié)果的準(zhǔn)確性；實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)有效提高了檢測(cè)的靈敏度。本方法準(zhǔn)確、靈敏、簡(jiǎn)便、快速，檢出低限均可達(dá)4fg/μl植物總RNA。
【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】
本專利技術(shù)涉及一種輔助鑒定煙草環(huán)斑病毒的試劑及其應(yīng)用。
技術(shù)介紹
煙草環(huán)斑病毒(Tobacco ringspot virus, TRSV), 1927年首次在美國(guó)弗吉尼亞煙草上發(fā)現(xiàn)并報(bào)道，現(xiàn)已分布于世界50多個(gè)國(guó)家。中國(guó)現(xiàn)在局部分布，官方控制，是我國(guó)進(jìn)境重要的檢疫對(duì)象。我國(guó)已從荷蘭進(jìn)口的蘿卜種子、美國(guó)進(jìn)口的大豆和塞爾維亞進(jìn)口的葵花種子等進(jìn)口貨物中截獲過(guò)該病毒。煙草環(huán)斑病毒隸屬豇豆花葉病毒科(Comoviridae)，是線蟲(chóng)傳多面體病毒屬(Nepovirus)的代表種。該病毒粒子是球狀、等軸、直徑約28 n m的二十面體，殼粒由60個(gè)外殼蛋白亞基組成。TRSV寄主范圍很廣，可侵染54科246種植物。自然寄主有豆類、瓜類、薯類、花卉和果樹(shù)等，發(fā)病后導(dǎo)致多種作物的產(chǎn)量下降50%以上。TRSV傳播途徑多樣，可通過(guò)種子傳播、嫁接、機(jī)械接種、媒介傳播。汁液接種易傳毒。種子傳毒，種傳寄主多且種傳率高，如大豆種傳率為40%-100%。苗木是遠(yuǎn)距離傳播的主要途徑。自然傳播介體為線蟲(chóng)Xiphinema americanum 和 X.rivesi。土壤中的美洲劍線蟲(chóng)(Xiphinema americanum)的成蟲(chóng)和3齡幼蟲(chóng)單頭線蟲(chóng)也能傳毒，線蟲(chóng)在24小時(shí)內(nèi)獲毒，感染的線蟲(chóng)貯藏在10°C下49周后仍可傳毒。煙薊馬(Thrips tabaci )的若蟲(chóng)、螨(Teranychus spp.)、葉蝶(Melanoplusdiffentials, M.mexicanus, M.femurrubrum)、煙草葉甲(Epitrix hirtipennis)和桃蟲(chóng)牙(Myzus persicae)也可傳毒。進(jìn)境糧谷、種子、苗木中植物病毒的檢測(cè)是我國(guó)檢驗(yàn)檢疫系統(tǒng)的重點(diǎn)，也是難點(diǎn)，尤其是木本植物中病毒的檢測(cè)，由于它們?cè)谥仓牦w內(nèi)含量低、分布不均，且時(shí)有復(fù)合侵染等特殊性，傳統(tǒng)的方法，極易 出現(xiàn)漏檢和誤檢。為了維護(hù)我國(guó)農(nóng)業(yè)的健康發(fā)展、防止煙草環(huán)斑病毒隨糧谷、種子、苗木等傳入中國(guó)，開(kāi)發(fā)出快速、靈敏檢測(cè)該病毒的先進(jìn)的技術(shù)，意義重大。近年來(lái)，國(guó)內(nèi)關(guān)于煙草環(huán)斑病毒檢測(cè)技術(shù)的研究報(bào)道較多，主要采用血清學(xué)方法、膠體金免疫層析法或分子生物學(xué)方法。如曹成等建立了雙重膠體金層析法快速檢測(cè)煙草環(huán)斑病毒的方法(曹成，魏梅生，張永江等，雙重膠體金層析法快速檢測(cè)番茄環(huán)斑病毒和煙草環(huán)斑病毒RT-PCR擴(kuò)增子.中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào)，2011，27 (22):197-201.);楊翠云等建立了RT-PCR和IC-RT-PCR檢測(cè)方法(楊翠云，曹潔，于翠，等.煙草環(huán)斑病毒RT-PCR和IC-RT-PCR檢測(cè)方法的研究.上海農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2007，23 (I):83-87.);易汪雪等建立了單管實(shí)時(shí)熒光RT-PCR方法。常規(guī)的RT-PCR方法檢測(cè)也有相關(guān)的報(bào)道(易汪雪，陳舜勝，楊翠云，等.單管實(shí)時(shí)熒光RT-PCR方法同時(shí)檢測(cè)大豆種子中的菜豆莢斑駁病毒和煙草環(huán)斑病毒.植物病理學(xué)報(bào)，2011,41(1):85-92.)。ELISA技術(shù)操作步驟繁瑣、檢測(cè)周期長(zhǎng)、靈敏度低、易出現(xiàn)假陽(yáng)性。PCR凝膠電泳技術(shù)較ELISA在多個(gè)方面有所提高，但易于造成污染。未見(jiàn)采用半巢式-實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)TRSV的研究報(bào)道。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
本專利技術(shù)的目的是提供一種輔助鑒定煙草環(huán)斑病毒的試劑及其應(yīng)用。本專利技術(shù)提供的輔助鑒定煙草環(huán)斑病毒的試劑，包括特異引物；所述特異引物由序列表的序列I所示DNA、序列表的序列2所示DNA和序列表的序列3所示DNA組成。所述試劑可由所述特異引物和特異探針組成；所述特異探針的核苷酸序列如序列表的序列4所示。所述特異探針可為TaqMan探針。所述試劑可用于制備輔助鑒定煙草環(huán)斑病毒的試劑盒。本專利技術(shù)還保護(hù)一種輔助鑒定煙草環(huán)斑病毒的試劑盒，包括所述試劑。所述試劑可用 于輔助鑒定煙草環(huán)斑病毒。本專利技術(shù)還保護(hù)一種輔助鑒定煙草環(huán)斑病毒的方法，包括如下步驟:以待測(cè)病毒的cDNA為模板，用特異引物對(duì)甲進(jìn)行PCR，得到PCR產(chǎn)物甲；以待測(cè)病毒的cDNA為模板，用特異引物對(duì)乙進(jìn)行PCR，得到PCR產(chǎn)物乙；如果PCR產(chǎn)物甲為309bp且PCR產(chǎn)物乙為245bp，待測(cè)病毒為候選的煙草環(huán)斑病毒；所述特異引物對(duì)甲為序列表的序列I所示DNA和序列表的序列3所示DNA組成的引物對(duì)；所述特異引物對(duì)乙為序列表的序列2所示DNA和序列表的序列3所示DNA組成的引物對(duì)。本專利技術(shù)還保護(hù)另一種輔助鑒定煙草環(huán)斑病毒的方法，包括如下步驟:以待測(cè)病毒的cDNA為模板，用特異引物對(duì)甲和特異探針進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR，得到擴(kuò)增曲線甲；以待測(cè)病毒的cDNA為模板，用特 異引物對(duì)乙和所述特異探針進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR，得到擴(kuò)增曲線乙；根據(jù)擴(kuò)增曲線甲和擴(kuò)增曲線乙判斷待測(cè)病毒是否為候選的煙草環(huán)斑病毒；所述特異引物對(duì)甲為序列表的序列I所示DNA和序列表的序列3所示DNA組成的引物對(duì)；所述特異引物對(duì)乙為序列表的序列2所示DNA和序列表的序列3所示DNA組成的引物對(duì)；所述特異探針為TaqMan探針，核苷酸序列如序列表的序列4所示。如果所述擴(kuò)增曲線甲和所述擴(kuò)增曲線乙均為陽(yáng)性，待測(cè)病毒為候選的煙草環(huán)斑病毒。所述待測(cè)病毒具體可為煙草環(huán)斑病毒、南方菜豆花葉病毒、菜豆莢斑駁病毒、花生矮化病毒、番茄環(huán)斑病毒或番茄斑萎病毒。本專利技術(shù)還保護(hù)一種檢測(cè)待測(cè)樣本中是否含有煙草環(huán)斑病毒的方法，包括如下步驟:(I)提取待測(cè)樣本的總RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA ；(2)以所述cDNA為模板，用特異引物對(duì)甲和特異探針進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR，得到擴(kuò)增曲線甲；以所述cDNA為模板，用特異引物對(duì)乙和所述特異探針進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR，得到擴(kuò)增曲線乙；根據(jù)擴(kuò)增曲線甲和擴(kuò)增曲線乙判斷待測(cè)樣本中是否含有煙草環(huán)斑病毒；所述特異引物對(duì)甲為序列表的序列I所示DNA和序列表的序列3所示DNA組成的引物對(duì)；所述特異引物對(duì)乙為序列表的序列2所示DNA和序列表的序列3所示DNA組成的引物對(duì)；所述特異探針為TaqMan探針，核苷酸序列如序列表的序列4所示。如果所述擴(kuò)增曲線甲和所述擴(kuò)增曲線乙均為陽(yáng)性,待測(cè)樣本含有煙草環(huán)斑病毒。所述TaqMan探針5’末端具體可連接有熒光報(bào)告染料FAM，3’末端具體可連接有熒光淬滅染料TAMRA。不同的方法，靈敏度和準(zhǔn)確性差異較大，如ELISA與PCR凝膠電泳方法靈敏度相差100倍以上，PCR凝膠電泳與實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)靈敏度相差也在100倍以上。即使同樣采用實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)，由于引物的擴(kuò)增效率不一樣，靈敏度差異也可達(dá)到1000倍以上。在實(shí)際檢測(cè)鑒定工作中，為了提高結(jié)果的準(zhǔn)確性，經(jīng)常需要對(duì)一個(gè)結(jié)果進(jìn)行兩個(gè)以上的確認(rèn)試驗(yàn)，不同方法檢測(cè)靈敏度不一樣，很難保證兩個(gè)試驗(yàn)的結(jié)果完全一樣，這就為結(jié)果的判斷增加了難度，特別是在檢測(cè)目標(biāo)含量極少的情況下，這種難度就會(huì)進(jìn)一步加大。若兩套方法檢測(cè)靈敏度一樣或非常接近，這個(gè)難題就迎刃而解。實(shí)時(shí)熒光PCR (Realtime-PCR)檢測(cè)技術(shù)是國(guó)際最近十余年發(fā)展起來(lái)的高新檢測(cè)技術(shù)，該技術(shù)將PCR擴(kuò)增與熒光檢測(cè)系統(tǒng)有機(jī)結(jié)合起來(lái)。與目前已報(bào)道的其它檢測(cè)技術(shù)相t匕，該技術(shù)具有巨大的優(yōu)越性，主要體現(xiàn)在:(a)能實(shí)時(shí)觀察PCR過(guò)程中待檢測(cè)樣品模板DNA(或cDNA)擴(kuò)增情況，無(wú)需進(jìn)行電泳、染色和紫外檢測(cè)，大大簡(jiǎn)化了操作程序并縮短檢測(cè)時(shí)間；(b)采用熒光信號(hào)放大功能，大大提高了靈敏度；(C)特異性本文檔來(lái)自技高網(wǎng)...
【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
一種輔助鑒定煙草環(huán)斑病毒的試劑，包括特異引物；所述特異引物由序列表的序列1所示DNA、序列表的序列2所示DNA和序列表的序列3所示DNA組成。
【技術(shù)特征摘要】
【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：粟智平，封立平，許紅巖，尹偉力，耿金培，李金慶，楊益娥，
申請(qǐng)(專利權(quán))人：粟智平，
類型：發(fā)明
國(guó)別省市：
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