軟骨素的生物技術制備制造技術

通過培養重組微生物制備軟骨素，所述重組微生物通過使產生軟骨素的果糖基化衍生物的微生物中編碼負責將果糖殘基加至線性軟骨素多糖的酶的基因失活而獲得。

【技術實現步驟摘要】
【國外來華專利技術】軟骨素的生物技術制備專利技術目的本專利技術涉及一種產生軟骨素的新的重組微生物以及軟骨素的生物技術制備方法。在本專利技術中，術語軟骨素指定義為線性糖胺聚糖的線性多糖，其由通過β 1-3 (GlcUA — GalNAc)鍵和 β 1-4 (GalNAc — GlcUA)鍵連接的 D-糖醛酸(GlcUA)和 N-乙酰-D-半乳糖胺(GalNAc)的交替殘基構成。
技術介紹
硫酸軟骨素為糖胺聚糖，其中糖醛酸(GlcUA)和N-乙酰-D-半乳糖胺(GalNAc)經β 1-3鍵和β 1-4鍵分別地線性和交替連接，來自在其GalNAc殘基中進行不同程度的硫酸化的線性多糖鏈。其存在于動物中，在軟骨和結締組織中，在細胞黏著、組織再生、神經延伸等中起到重要作用。從非動物源制備軟骨素是通向非動物來源的硫酸軟骨素制備的重要且期望的步驟。已有的專利文獻 描述了幾種制備非動物來源的軟骨素的方法。此外，已經克隆并測序了來自動物和微生物的幾種軟骨素合酶基因。已經提供了使用導入來自多殺性巴氏桿菌(Pasteurella multocida)的軟骨素合酶基因的重組革蘭氏陽性芽孢桿菌制備軟骨素的方法(US2007/0281342A1)。另一專利技術描述了通過將來自大腸桿菌05:K4:H4(Escherichia coli05:K4:H4A)的kfoC和kfoA基因導入產生UDP-糖醛酸的細菌中制備軟骨素的方法(W02008/133350)。另一專利技術描述了包括大腸桿菌05:K4:H4軟骨素合酶和前體反應的酶體系中的體外軟骨素合成(US2009/0263867A1)。已知大腸桿菌05:K4:H4能夠產生與軟骨素具有相同主鏈結構的莢膜多糖(K4多糖)，果糖殘基連接于其上的GlcUA殘基(參見，例如N.Volpi，Glycoconj.J.(2008)25:451-457) ο因此，K4多糖由重復的三糖單元組成，所述三糖單元包括經β 1-3 (GlcUA — GalNAc)連接的D-糖醛酸(GlcUA)部分和N-乙酰-D-半乳糖胺(GalNAc)部分以及結合于所述GlcUA殘基的C3-羥基的果糖殘基。因此，果糖殘基構成所得線性多糖的分支。通過酸性條件中的水解處理已經實現果糖殘基的去除(N.Volpi,Electrophoresis25,692-696(2004))。盡管已經廣泛研究了大腸桿菌05:K4:H4莢膜抗原基因簇以及產生組成K4線性多糖的糖的代謝途徑，迄今為止，還沒有發現負責將果糖部分加至線性多糖得到K4多糖的糖基轉移酶活性。本專利技術的新特征為通過失活基因獲得的重組微生物直接制備高分子量軟骨素，所述基因編碼負責將果糖殘基加至軟骨素主鏈的酶，從而消除了將K4多糖進行結合于GlcUA部分的果糖殘基的水解去除來獲得軟骨素的需要。專利技術詳述本專利技術的目的為提供產生軟骨素的重組微生物，所述軟骨素定義為分別由通過β 1-3鍵和β 1-4鍵連接的D-糖醛酸(GlcUA)和N-乙酰-D-半乳糖胺(GalNAc)的交替殘基組成的線性糖胺聚糖，其特征在于，在所述微生物中編碼負責將果糖殘基加至軟骨素主鏈的酶的基因被失活。因此，根據本專利技術的一個方面，提供一種產生軟骨素的重組微生物，其特征在于，所述微生物通過將原始存在于其中的基因進行失活而獲得，所述基因編碼負責將果糖殘基加至線性軟骨素主鏈的蛋白質，所述失活包括全部或部分缺失或取代所述基因或通過插入另外的核苷酸序列進行干擾。根據本專利技術的一個優選方面，通過失活編碼具有果糖基轉移酶活性的蛋白質的基因獲得的本專利技術的重組微生物來自屬于大腸桿菌種的細菌、優選地屬于包括公知的血清型如Κ1、Κ5、Κ7、Κ12的2類K抗原。盡管根據本專利技術的代表性實施方案，具有產生軟骨素能力的重組微生物來自大腸桿菌05:Κ4:Η4，可以使用任何屬于K抗原類的微生物，不管其與大腸桿菌05:Κ4:Η4是否共享任何基因同源性。所述微生物的實例包括屬于嗜血桿菌屬的細菌，如流感嗜血桿菌(H.1nfluenzae)(Branefors-Helander P.,Carbohydr.Res., 1981, Janl5,88)，彎曲桿菌屬的細菌，如空腸彎曲桿菌(C.jejuni) (McNally DJ, Jarrell HC, Li J, Khieu NH,Vinogradov E, Szymanski CM, Brisson JR., FEBS J.2005Sep; 272),粘球藻屬的細菌，如膠質粘球藻(G.Gelatinosa) (Raungsomboon S, Chidthaisong A, Bunnag B, InthornD, Harvey NW., Water Res.2006Dec ；40)和弧菌屬的細菌，如霍亂弧菌(V.cholerae)(Knirel YA, Widmalm G,Senchenkova SN,Jansson PE,Weintraub A-Eur J Biochem,1997,Jull, 247)。更優選地，產生軟骨素的本專利技術的重組微生物所來自的細菌為大腸桿菌血清型05:K4:H4，其含有編碼具有果糖基轉移酶活性的蛋白質的kfoE基因。 已知kfoE位于大腸桿菌(E.coli) K4抗原基因簇(GenBankAB079602)內，該基因簇含有本專利技術人發現的基因，與來自其它微生物的、可能參與細菌莢膜產生的基因具有顯著同源性(T.Ninomiya, N.Sugiura, A.Tawada, K.Sugimoto, H.Watanabe andK.Kimata-JBC, 2002，vol.277，June14, N。24，21567-75)。最優選用于獲得本專利技術的重組微生物的細菌為大腸桿菌05:K4:H4菌株U1-41可由ATCC(美國典型培養物保藏中心，Manassas-Virginia，US)獲得，保藏號ATCC23502。根據本專利技術的代表性實施方案，所述重組微生物為產生軟骨素的微生物，其中進行失活的基因為編碼選自以下(A)、(B)、(C)的蛋白質的基因:(A)包含SEQ ID N。2的氨基酸序列的蛋白質(B)包含經缺失、取代或插入一個或多個氨基酸修飾的SEQ ID N0 2的氨基酸序列且具有果糖基轉移酶活性的蛋白質。(C)包含與SEQ ID N。2的氨基酸序列具有至少50%同源性的氨基酸序列且具有果糖基轉移酶活性的蛋白質。根據本專利技術的微生物為其中失活的基因為kfoE基因或選自以下(a)、(b)、(C)的DNA的微生物:(a)包含SEQ ID N。I的核苷酸序列的DNA(b)與包含互補于SEQ ID N° I的核苷酸序列的DNA雜交且編碼具有果糖基轉移酶活性的蛋白質的DNA。(c)包含與SEQ ID N0 I的核苷酸序列具有至少50%同源性的核苷酸序列且編碼具有果糖基轉移酶活性的蛋白質的DNA。本專利技術的一個目的為一種產生軟骨素的微生物，其中通過修飾kfoE的核苷酸序列獲得kfoE失活，例如，通過全部或部分缺失或取代以上(a)、(b)或(C)所述的核苷酸序列。本專利技術的另一目的為一種微生物，其中通過將一個或多個核苷酸插入以上(a)、(b)或(C)所述的核苷酸序列獲得kfoE失活。根據本專利技術最優選的方面，通過核苷酸缺失來失活編碼假定的果糖基轉移酶的k本文檔來自技高網...

【技術保護點】

【技術特征摘要】
【國外來華專利技術】...

【專利技術屬性】
技術研發人員：A·特里利，I·布瀉洛，S·戴利，F·巴加廷，
申請(專利權)人：靈知股份公司，
類型：
國別省市：