引物對及其應用及檢測SEPT9DNA甲基化狀態的試劑盒制造技術

本發明專利技術公開了一種引物對，其中，該引物對包括：如SEQ?ID?No：1所示的上游引物和如SEQ?ID?No：2所示的下游引物。本發明專利技術還公開了一種檢測SEPT9DNA甲基化狀態的試劑盒，其中，該試劑盒包括：如上所述的引物對和阻攔序列；所述阻攔序列為在對經亞硫酸氫鹽處理的SEPT9DNA進行PCR擴增的退火過程中，優先于如上所述的引物對特異性結合到未甲基化的SEPT9DNA上，并阻止如上所述的引物對與未甲基化的SEPT9DNA結合的核苷酸序列；所述SEPT9DNA為經亞硫酸氫鹽處理的SEPT9DNA。本發明專利技術另外公開了一種如上所述的引物對在制備用于檢測SEPT9DNA甲基化狀態的試劑盒中的應用。

【技術實現步驟摘要】

本專利技術涉及一種引物對及檢測SEPT9DNA甲基化狀態的試劑盒，以及所述引物對在制備用于檢測SEPT9DNA甲基化狀態的試劑盒中的應用。
技術介紹
結直腸癌是較為常見的惡性腫瘤，發病率呈逐年上升趨勢。據統計，世界范圍內2007年新增結直腸癌病例數為120萬，當年因結直腸癌死亡人數達60萬，在西方國家其發病率居惡性腫瘤譜的第二位。隨著生活水平的不斷提高和飲食習慣的改變，我國結直腸癌的發病率也日漸增高，在我國大城市的結直腸癌致死率排在第四，鄉村結直腸癌致死率排在第五。結直腸癌的發生是多種遺傳和后天變化轉化正常的粘膜為癌前病變腺瘤，以致最終的結直腸癌。及時發現和去掉前期腺瘤可以顯著地降低結直腸癌病人的死亡率。結直腸癌早期診斷并手術的病人五年生存率可以達到90%以上。但是晚期結直腸癌病人五年生存率低于10%。因此，提高結直腸癌診斷特別是早期診斷是非常重要的。早期結直腸癌常常沒有癥狀。這表明需要對適齡的沒有癥狀的人群進行結直腸癌普查。目前，普遍使用的結直腸癌檢查方法主要有兩種：一是結直腸鏡檢查，這是檢測結直腸癌的金標準，但該方法有侵入性，昂貴，不易操作，并大部適齡人群難以接受，很難用于大規模普查。二是糞便隱匿血檢測和糞便免疫組化檢測，主要通過檢測糞便里的血跡來作為結直腸癌早期診斷的依據，該方法雖然是非侵入性的，廉價的，但是缺乏靈敏性和特異性。在過去的幾十年，隨著基因組學、遺傳學和分子生物學技術的飛速發展，研究發現：對比正常組織，在結直腸癌腫瘤中基因p16、ALX4、SEP9、TMEFF2、BMMP3、EYA2和Vimentin有不正常的甲基化。這些基因是潛在的結直腸癌生物標記物。非細胞外周血中的DNA研究表明，釋放到血液中的腫瘤DNA可以作為生物標記物用來檢測腫瘤。但目前現有的方法對結直腸癌檢測的特異性和靈敏度均較低。
技術實現思路
本專利技術的目的是為了克服現有結直腸癌檢測方法特異性和靈敏度低的缺陷，提供一種能夠高特異性和靈敏度檢測結直腸癌的引物對和試劑盒，以及所述引物對在制備用于檢測SEPT9基因甲基化狀態的試劑盒中的應用。為了實現上述目的，本專利技術提供了一種引物對，其中，該引物對包括：如SEQ?ID?No：1所示的上游引物和如SEQ?ID?No：2所示的下游引物。另一方面，本專利技術提供了一種檢測SEPT9DNA甲基化狀態的試劑盒，其中，該試劑盒包括：如上所述的引物對和阻攔序列；所述阻攔序列為在對經亞硫酸氫鹽處理的SEPT9DNA進行PCR擴增的退火過程中，優先于如上所述的引物對特異性結合到未甲基化的SEPT9DNA上，并阻止如上所述的引物對與未甲基化的SEPT9DNA結合的核苷酸序列。再一方面，本專利技術還提供了一種如上所述的引物對在制備用于檢測SEPT9DNA甲基化狀態的試劑盒中的應用。通過上述技術方案，能夠有效地提高SEPT9DNA甲基化檢測的靈敏度和特異性，其檢測的敏感度可高達90%、特異度高達88%。因此，本專利技術的引物和試劑盒能夠更好地防治結直腸癌，從而降低結直腸癌對人類健康的危害。本專利技術的其他特征和優點將在隨后的具體實施方式部分予以詳細說明。具體實施方式以下將對本專利技術的具體實施方式進行詳細說明。應當理解的是，此處所描述的具體實施方式僅用于說明和解釋本專利技術，并不用于限制本專利技術。一方面，本專利技術提供了一種引物對，其中，該引物對包括：如SEQ?ID?No：1所示的上游引物（5’-GYGYGATTYGTTGTTTATTAGTTATT-3’）和如SEQ?ID?No：2所示的下游引物（5’-CCRAAATAATCCCATCCAAC-3’）。其中，Y和R均為退化堿基，Y為C或T，R為A或G。另一方面，本專利技術提供了一種檢測SEPT9DNA甲基化狀態的試劑盒，其中，該試劑盒包括：如上所述的引物對和阻攔序列；所述阻攔序列為在對經亞硫酸氫鹽處理的SEPT9DNA進行PCR擴增的退火過程中，優先于如上所述的引物對特異性結合到未甲基化的SEPT9DNA上，并阻止如上所述的引物對與未甲基化的SEPT9DNA結合的核苷酸序列。需要指明的是，本文中，所述SEPT9DNA是指SEPT9基因的V2啟動子區，研究發現，在結直腸癌的組織樣本中，該區域內的甲基化水平最高，而在正常人群或患有其它疾病的人群中，該區域內的甲基化水平最低。因此，檢測該區域內DNA的甲基化水平能夠有效地進行結直腸癌的診斷。SEPT9DNA的V2啟動子區的核苷酸序列如SEQ?ID?No：17所示（GCGCGATTCGTTGTTTATTAGTTATTATGTCGGATTTCGCGGTTAACGCGTAGTTGGATGGGATTATTTCGG），其中，該基因中加有下劃線的核苷酸為甲基化區域。另外，本專利技術還需要指出的是，所述SEPT9DNA可以是甲基化的SEPT9DNA，也可以是未甲基化的SEPT9DNA，還可以是甲基化的SEPT9DNA和未甲基化的SEPT9DNA的混合SEPT9DNA。所述經亞硫酸氫鹽處理的SEPT9DNA是指對上述甲基化的或未甲基化的或混合的SEPT9DNA進行亞硫酸氫鹽處理。其中，所述亞硫酸氫鹽處理具有本領域公知的含義，也即，所述亞硫酸氫鹽處理能夠將未甲基化的胞嘧啶轉化為尿嘧啶，而保持所有甲基化的胞嘧啶不變。根據本專利技術，本領域技術人員能夠理解的是，在退火的過程中，所述阻攔序列（blocker）優先于如上所述的引物對特異性結合到未甲基化的SEPT9DNA上，是指blocker的復性溫度高于所述引物的復性溫度，并且blocker只與經亞硫酸氫鹽處理的未甲基化的SEPT9DNA相結合。此處“阻止如上所述的引物對與未甲基化的SEPT9DNA結合”是指blocker的序列長度能夠部分覆蓋如上的引物對在經亞硫酸氫鹽處理的DNA模板上的結合區，從而能夠阻止引物對與經亞硫酸氫鹽處理的未甲基化的SEPT9DNA結合。根據本專利技術，所述blocker的核苷酸序列沒有特別的限制，只要其能夠具有如上的特性即可。本領域技術人員能夠根據本專利技術提供的引物對以及如上的blocker的特性，利用本領域常規的技術手段，得到符合本專利技術要求的blocker。優選的情況下，所述blocker的核苷酸序列如SEQ?ID?No：3所示（5'-TCCAACTACACATTAACCACAAAATCCAACATAATAACT-3'），或者為將SEQ?ID?No：3所示的序列經過一個或多個核苷酸的取代、缺失或添加后仍具有所述blo本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種引物對，其特征在于，該引物對包括：如SEQ?ID?No：1所示的上游引物和如SEQ?ID?No：2所示的下游引物。

【技術特征摘要】
1.一種引物對，其特征在于，該引物對包括：如SEQ?ID?No：1所示的
上游引物和如SEQ?ID?No：2所示的下游引物。
2.一種檢測SEPT9DNA甲基化狀態的試劑盒，其特征在于，該試劑盒
包括：權利要求1所述的引物對和阻攔序列；所述阻攔序列為在對經亞硫酸
氫鹽處理的SEPT9DNA進行PCR擴增的退火過程中，優先于權利要求1所
述的引物對特異性結合到未甲基化的SEPT9DNA上，并阻止權利要求1所
述的引物對與未甲基化的SEPT9DNA結合的核苷酸序列。
3.根據權利要求2所述的試劑盒，其中，所述阻攔序列為SEQ?ID?No：
3所示的序列，或者將SEQ?ID?No：3所示的序列經過一個或多個核苷酸的
取代、缺失或添加后仍具有所述阻攔序列的性能的核苷酸序列；優選地，所
述阻攔序列為SEQ?ID?No：3、SEQ?ID?No：4、SEQ?ID?No：5、SEQ?ID?No：
6和SEQ?ID?No：7所示的序列中的一種或多種。
4.根據權利要求2或3所述的試劑盒，其中，所述試劑盒中還含有熒
光染料和/或SEPT9Taqman探針，所述SEPT9Taqman探針能夠在對經亞硫
酸氫鹽處理的SEPT9DNA進行PCR擴增的退火過程中，優先于權利要求1
所述的引物對特異性結合到SEPT9DNA的非引物結合處。
5.根據權利要求4所述的試劑盒，其中，
所述染...

【專利技術屬性】
技術研發人員：李勁風，于耕，
申請(專利權)人：北京神源德生物科技有限公司，
類型：發明
國別省市：北京;11