低能離子注入介導Ri質粒轉化誘導黃芩毛狀根的方法技術

本發明專利技術公開了一種低能離子注入介導Ri質粒轉化誘導黃芩毛狀根的方法，主要是利用低能離子注入介導技術高效、定向地將Ri質粒導入黃芩外植體中，促使Ri質粒與黃芩基因組發生重組整合，實現誘導黃芩毛狀根的目的，所得的黃芩毛狀根形態上多叢生，分枝多，無向地性，能夠不依賴激素快速生長，能穩定生物合成黃芩苷，誘導率可達20～55％，黃芩苷含量可達16.47～19.56％。本發明專利技術提供的方法不僅操作簡便，適用范圍更廣泛，將為單子葉植物及裸子植物的毛狀根體系建立奠定基礎。

【技術實現步驟摘要】
【專利摘要】本專利技術公開了一種，主要是利用低能離子注入介導技術高效、定向地將Ri質粒導入黃芩外植體中，促使Ri質粒與黃芩基因組發生重組整合，實現誘導黃芩毛狀根的目的，所得的黃芩毛狀根形態上多叢生，分枝多，無向地性，能夠不依賴激素快速生長，能穩定生物合成黃芩苷，誘導率可達20～55％，黃芩苷含量可達16.47～19.56％。本專利技術提供的方法不僅操作簡便，適用范圍更廣泛，將為單子葉植物及裸子植物的毛狀根體系建立奠定基礎。【專利說明】
本專利技術屬于黃芩的人工培育
，具體涉及一種黃芩毛狀根的誘導方法。
技術介紹
藥物植物被發根農桿菌(Agrobacterium rhizogenes)感染后,在傷口處就會形成不定根，不定根除菌后能迅速生長，并產生多個分枝，呈毛發狀，該不定根又被稱為毛狀根(Hairy roots)。自1907年Smith和Townsend發現發根農桿菌能誘導植物形成毛狀根后，1930年Riker等再次闡述了該現象。隨著植物生物技術的發展，有關毛狀根的研究進展十分迅速，除了探求外源基因導入植物細胞的機制和植物激素的生理效應外，應用毛狀根生物技術誘導植物次生代謝產物的形成與生物轉化等研究也有很大發展。到20世紀末，國內外學者已建立了分屬于31個科的100余種植物的毛狀根培養體系，并進行次級代謝產物的生產和調控,包括苷類、生物堿、醌類、芳香油、酚類、黃酮等多種天然產物。毛狀根培養技術已被認為是生產藥用植物次生代謝產物的一條重要途徑，具有非常廣泛的應用前景。發根農桿菌之所以具有這種致根性，是因為它具有能誘導毛狀根產生的Ri質粒。Ri質粒是發根農桿菌染色體外的一個約250kb的大質粒，帶有冠癭合成酶基因。在Ri質粒上，存在與轉化有關的 兩個主要功能區，即T-DNA (轉移區)和Vir (致病區)。Vir區基因并不發生轉移，但它對T-DNA的轉移非常重要。當發根農桿菌感染植物時Ri質粒上的T-DNA可以轉化并插入到植物細胞基因組中，其整合和表達的結果導致了大量毛狀根的產生。Ri質粒誘導的發根具有生長迅速、激素自養、生長條件簡單、次生代謝產物含量高且穩定，分化程度高、不易變異等特點，而且可把二次代謝物分泌至培養基中。盡管發根培養技術應用于植物次生代謝生產的歷史較短，但該技術發展迅速，特別是在一些有價值的藥用植物次生代謝產物的生產上，但是該技術在推廣過程中遇到了一些問題，如有些植物發根難以誘導，尤其是單子葉植物和裸子植物，這主要歸因于發根農桿菌對這些植物的侵染能力較弱，致使處于發根農桿菌體內的Ri質粒不能轉入到植物體內；同時，利用發根農桿菌誘導產生毛狀根后，必須盡快除去毛狀根吸附的發根農桿菌，使毛狀根在無菌條件下生長。針對這些問題，亟需開發一種高效的轉Ri質粒誘導毛狀根的方法。低能離子注入技術是20世紀80年代由我國科學家余增亮研究員等人開創和拓展的多學科交叉的新興研究技術，目前已被廣泛運用于生物品種改良。在此基礎上，我國學者自主開發了低能離子注入介導的轉基因技術。作為一種新的轉基因方法，低能離子注入介導的轉基因技術有其自身的特點:(1)注入離子對細胞具有極強的刻蝕作用，致使細胞表面形成可使外源DNA進入的通道，加上由于注入正離子的積累，大大降低了細胞表面的負電性，從而減少了細胞對帶負電的外源DNA的靜電排斥力，提高了外源DNA的導入。(2)低能離子注入介導轉入的外源DNA是直接整合入宿主總DNA中，因此具有較好的遺傳穩定性。(3)低能離子注入介導的轉基因技術是通過將能量較高的離子射入生物體內，通過能量沉積、質量沉積和電荷交換的機制使生物體產生自由基、染色結構變異或者DNA分子的斷裂、堿基插入、缺失、重復等生物學效應而產生生物突變體。目前，低能離子注入介導外源DNA轉化無論在理論上還是實際應用上都取得了顯著成果。目前尚未見將低能離子注入轉基因方法運用于誘導藥用植物毛狀根的研究報道。
技術實現思路
本專利技術的目的在于提供一種。為達到上述目的，本專利技術 采用了以下技術方案:I)將黃芩外植體轉接到含50~200 μ g/mL乙酰丁香酮的MS固體培養基中，轉接后于25~28°C黑暗培養2~3天，培養后用無菌水將黃芩外植體表面的培養基沖洗干凈，沖洗干凈后將黃芩外植體表面的無菌水用無菌風吹干，吹干后在黃芩外植體上劃痕；2)經過步驟I)后，將黃芩外植體放置于離子注入機的真空靶室內，然后對黃芩外植體進行低能離子注入；3)將經過低能離子注入的黃芩外植體浸泡入含Ri質粒的TE緩沖溶液中并進行避光溫育，溫育的時間為2~4h,溫育的溫度為25~28°C,然后將黃岑外植體接種于含0.1~0.5mg/L吲哚-3- 丁酸的MS固體培養基中，接種后于25~28°C黑暗培養21~25天誘導出毛狀根。所述黃芩外植體為切成0.5~1.0cm的黃芩帶節莖段的碎段。所述含Ri質粒的TE緩沖溶液中Ri質粒的濃度為≥200 μ g/mL。所述離子注入的條件為:以N+作為注入離子，最佳注入劑量為2.5X1016~3.5X 1016ions/cm2，最佳注入能量為25~30KeV,脈沖時間為5~IOs,間隔時間為5~IOs,真空度為1.5~2.0XlO-4Pa0本專利技術具有以下有益的技術效果:1、本專利技術所述誘導黃芩毛狀根的方法通過低能離子注入介導的Ri質粒誘導黃芩屬黃岑得到毛狀根，結合基因間隔序列(intergenic transcribed spacer, ITS)基因檢測分析，鑒定所得毛狀根為黃芩屬黃芩毛狀根，誘導率可達20~55%，在液體培養基培養后，所得黃芩毛狀根呈黃色，能穩定生物合成黃芩苷，黃芩苷含量可達16.47~19.56%。2、本專利技術所述誘導黃芩毛狀根的方法基于Ri質粒轉化植物后，Ri質粒上的T-DNA片段整合入植物細胞核基因組中，使植物外植體產生毛狀根的原理。與現有技術的不同之處在于，本專利技術所述Ri質粒轉化方法是利用低能離子注入技術對植物表面具有高效冷刻蝕作用的特點，將來源于農桿菌的Ri質粒高效導入黃芩外植體中，誘導黃芩毛狀根的生成，解決了現有技術只能依靠發根農桿菌對植物自然侵染能力的大小實現轉移Ri質粒進行誘導毛狀根的目的，提高了黃芩毛狀根誘導的高效性，為黃芩毛狀根的誘導開辟出一條有效途徑。3、本專利技術所述誘導黃芩毛狀根的方法不需要發根農桿菌與植物外植體共培養，毛狀根也無需脫菌處理，解決了毛狀根誘導過程中，植物外植體與農桿菌共培養時間過長或過短引起植物細胞受到毒害而死亡的問題，操作簡便，誘導效率得到提高。4、對于步驟I)至步驟3)，現有技術中利用低能離子介導轉化質粒(或基因片斷)的相關研究表明，影響轉化率的因子有離子的能量、劑量、每次脈沖處理劑量、離子質量數和化學性質等。其中，離子能量和劑量的增加有助于刻蝕樣品產生微通道，但注入離子能量和劑量過高會引起靶材料遺傳物質突變，適于誘變育種。因此，在植物轉基因研究中，要求各種處理及培養條件盡量減小不必要的突變，所以離子束能量和劑量并不是越高越好。為此，當低能離子介導轉化用至本專利技術時，本專利技術以黃芩外植體為研究對象，并在其表面進行劃痕處理以及利用高濃度(400 μ g/mL)的Ri質粒進行轉化以達到外源質粒的高效導入的目的，實現在提高轉化效率的同時減少低能離子注入引發的宿主不必要的本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種低能離子注入介導Ri質粒轉化誘導黃芩毛狀根的方法，其特征在于，包括以下步驟：1)將黃芩外植體轉接到含50～200μg/mL乙酰丁香酮的MS固體培養基中，轉接后于25～28℃黑暗培養2～3天，培養后用無菌水將黃芩外植體表面的培養基沖洗干凈，沖洗干凈后將黃芩外植體表面的無菌水用無菌風吹干，吹干后在黃芩外植體上劃痕；2)經過步驟1)后，將黃芩外植體放置于離子注入機的真空靶室內，然后對黃芩外植體進行低能離子注入；3)將經過低能離子注入的黃芩外植體浸泡入含Ri質粒的TE緩沖溶液中并進行避光溫育，溫育的時間為2～4h，溫育的溫度為25～28℃，然后將黃芩外植體接種于含0.1～0.5mg/L吲哚?3?丁酸的MS固體培養基中，接種后于25～28℃黑暗培養21～25天誘導出毛狀根。

【技術特征摘要】

【專利技術屬性】
技術研發人員：錢衛東，王婷，付云芳，蔡長龍，毛培宏，施春陽，
申請(專利權)人：陜西科技大學，
類型：發明
國別省市：陜西;61