一種將外源基因導入粳稻品種8m30的水稻細胞的方法技術

本發明專利技術提供了一種將外源基因導入粳稻品種8m30的水稻細胞的方法。具體地講，本發明專利技術是通過農桿菌介導，將外源基因導入到閉穎授粉的粳稻品種8m30中。在遺傳轉化過程中，本發明專利技術采用了特制的培養基以及比常規介導方法更好地轉化方式。通過PCR檢測鑒定，表明外源基因已導入8m30中。該方法成功實現了閉穎授粉的粳稻品種的遺傳轉化，在加快性狀改良過程同時，可避免花粉外傳導致的基因漂移。

【技術實現步驟摘要】

本專利技術涉及生物技術和植物基因工程
。具體而言，本專利技術涉及一種將外源基因導入到閉穎授粉的粳稻品種8m30的遺傳轉化方法。
技術介紹
水稻(Oryza sativa L.)是我國乃至世界上最重要的糧食作物，世界上60%以上的人口以稻米為主食。近年來面對日益頻繁的干旱、極端溫度等非生物脅迫的影響，人口增長和生態環境的壓力，現代生物技術手段，特別是轉基因技術在作物遺傳改良方面的重要性日漸凸顯。轉基因技術為農作物的產量提升、品質改良和抗性增強提供了新路徑、開拓了新空間。但隨著轉基因作物的種植范圍迅速擴大，轉基因作物及其產品的安全性，引起了廣泛關注。例如轉基因品種花粉外傳會帶來基因漂移，可能產生“超級雜草”等風險，但目前缺乏實用有效的技術手段加以克服，比如物理隔離需要一定的空間阻止花粉傳播(水稻需在IOOm以上)，只適于小面積實驗，在大面積生產中是不切實際的。 而閉穎授粉品種在整個授粉過程中，穎花不張開，花藥不外露，花粉不會向外傳播，可以有效抑制花粉外傳，避免基因污染。通過閉穎受體來解決基因污染問題，是目前被認為最可行的技術手段，但目前生產還缺乏實用化的閉穎水稻品種。本實驗室創制的8m30等閉穎授粉粳稻品種，不僅完全閉穎授粉，而且結實率、株高等重要農藝性狀較好，可作為理想的轉基因受體應用于品種快速遺傳改良，減少生態風險。但目前還沒有閉穎授粉水稻品種的遺傳轉化方法的報道。
技術實現思路
為充分利用具有閉穎授粉性狀的獨特遺傳資源，本專利技術旨在建立一種適用于閉穎授粉粳稻品種的遺傳轉化方法。本專利技術的目的是提供一種通過農桿菌介導，將外源基因導入到閉穎授粉的粳稻品種8m30的遺傳轉化方法，以及基于該方法來制備轉基因水稻植株的方法。本專利技術提供了下列技術方案來實現該目的。具體而言，在一個方面，本專利技術提供，包括下述步驟:步驟1、將粳稻品種8m30的種子去殼、滅菌后將胚分離出來，置于愈傷組織誘導培養基上以產生次級愈傷組織；步驟2、將所述次級愈傷組織轉移至新的愈傷組織誘導培養基進行預培養；步驟3、將步驟2中獲得的愈傷組織與攜帶外源基因的農桿菌接觸持續第一預定時間段；步驟4、將步驟3所獲得的愈傷組織轉移到墊有無菌濾紙的培養皿中，21_23°C培養第二預定時間段，所述無菌濾紙中加入2.5-3.5mL農桿菌懸浮培養基；步驟5、將步驟4處理后的愈傷組織置于前篩選培養基上培養5-7天；步驟6、將步驟5處理后的愈傷組織轉移到篩選培養基上，以獲得抗性愈傷組織；步驟7、將所述抗性愈傷組織轉移到分化再生培養基中分化成苗；和步驟8、將步驟7所獲得的苗轉移到生根培養基中生根。在一種優選實現方式中，所述組織誘導培養基中[N<V]/[NH4+] = 40mM/10mM ；所述前篩選培養基中[NO3-] / [NH4+] = 40mM/10mM ;在所述分化再生培養基中[NO3I/[NH4+] = 40mM/10mM，并且含 1.5mg/L 萘乙酸(NAA)和 lmg/L6_ 芐氨基嘌呤(6-BA)；所述生根培養基中含0.4mg/L的萘乙酸。在一種優選實現方式中，所述步驟I中的種子是成熟種子；和/或所述步驟1、2中的誘導培養基包括:(優化的或預定配比的N6)大量元素、B5微量元素、MS鐵鹽、B5維生素、500mg/L脯氨酸、500mg/L谷氨酰胺、300mg/L酪蛋白酶水解物、30g/L蔗糖、2mg/L2，4-二氯苯氧乙酸(2，4-D)、3g/L植物凝膠，該誘導培養基的pH為5.80 ；和/或所述步驟3中的與農桿菌接觸是將愈傷組織浸泡在農桿菌懸浮液中，農桿菌中攜帶有外源基因；和/或所述步驟4中的 農桿菌懸浮培養基包括:(優化的或預定配比的N6)大量元素、B5微量元素、MS鐵鹽、B5維生素、500mg/L脯氨酸、500mg/L酪蛋白酶水解物、2mg/L2, 4-D、20g/L鹿糖、10g/L葡萄糖、100 μ mol/L乙酰丁香酮,該農桿菌懸浮培養基的pH為5.20 ;和/或所述步驟5中的前篩選培養基包括所述愈傷組織誘導培養基以及250mg/L羧芐青霉素；和/或所述步驟6中的篩選培養基包括所述愈傷組織誘導培養基以及50mg/L潮霉素和250mg/L羧芐青霉素；和/或所述步驟7中的分化再生培養基包括大量元素、B5微量元素、MS鐵鹽、B5維生素、lg/L酪蛋白酶水解物、30g/L蔗糖、30g/L 山梨醇、500mg/L MES,2.5mg/L CuS04、l.5mg/L萘乙酸、lmg/L6-BA、AA氨基酸、25mg/L潮霉素、125mg/L羧節青霉素、2.5g/L植物凝膠,該分化再生培養基PH值為5.80 ;和/或所述步驟8中的生根培養基包括1/2MS (Murashige&Skoog)基礎鹽2.165g/L、MS維生素、20g/L鹿糖、25mg/L潮霉素、0.4mg/L萘乙酸、125mg/L羧節青霉素、3.5g/L植物凝膠，該生根培養基pH值為5.80。在一種優選實現方式中，所述大量元素中[N<V]/[NH4+] = 40mM/10mM,包括KN0340mM, (NH4) 2S045mM, MgSO4.7H200.75mM, ΚΗ2Ρ042.93mM CaCl2.2Η201.13mM。在一種優選實現方式中，所述第一預定時間段為15分鐘；所述第二預定時間段為48小時。在一種優選實現方式中，所述步驟3包括選取分裂旺盛的愈傷組織收集至50mL的無菌離心管中與農桿菌接觸。另一方面，本專利技術提供一種生產轉基因水稻的方法，包括:I)通過上述方法將預定外源基因導入水稻細胞；和2)利用導入了所述外源基因的水稻細胞培育水稻植株。在另一個方面，本專利技術提供一種用于轉化水稻的培養基套組，包括如下所述的組分:(I)愈傷組織誘導培養基；(2)農桿菌懸浮培養基；(3)前篩選培養基；(4)篩選培養基；(5)分化再生培養基；(6)生根培養基。其中所述(1)-(6)分別包含如說明書表1所示的成分。表1培養基的示例性配方 本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種將外源基因導入粳稻品種8m30的水稻細胞的方法，包括下述步驟：步驟1、將粳稻品種8m30的種子去殼、滅菌后將胚分離出來，置于愈傷組織誘導培養基上以產生次級愈傷組織；步驟2、將所述次級愈傷組織轉移至新的愈傷組織誘導培養基進行預培養；步驟3、將步驟2中獲得的愈傷組織與攜帶所述外源基因的農桿菌接觸持續第一預定時間段；步驟4、將步驟3所獲得的愈傷組織轉移到墊有無菌濾紙的培養皿中，21?23℃培養第二預定時間段，所述無菌濾紙中加入2.5?3.5mL農桿菌懸浮培養基；步驟5、將步驟4處理后的愈傷組織置于前篩選培養基上培養5?7天；步驟6、將步驟5處理后的愈傷組織轉移到篩選培養基上，以獲得抗性愈傷組織；步驟7、將所述抗性愈傷組織轉移到分化再生培養基中分化成苗；和步驟8、將步驟7所獲得的苗轉移到生根培養基中生根。

【技術特征摘要】
1.一種將外源基因導入粳稻品種8m30的水稻細胞的方法，包括下述步驟: 步驟1、將粳稻品種8m30的種子去殼、滅菌后將胚分離出來，置于愈傷組織誘導培養基上以產生次級愈傷組織； 步驟2、將所述次級愈傷組織轉移至新的愈傷組織誘導培養基進行預培養； 步驟3、將步驟2中獲得的愈傷組織與攜帶所述外源基因的農桿菌接觸持續第一預定時間段； 步驟4、將步驟3所獲得的愈傷組織轉移到墊有無菌濾紙的培養皿中，21-23°C培養第二預定時間段，所述無菌濾紙中加入2.5-3.5mL農桿菌懸浮培養基； 步驟5、將步驟4處理后的愈傷組織置于前篩選培養基上培養5-7天； 步驟6、將步驟5處理后的愈傷組織轉移到篩選培 養基上，以獲得抗性愈傷組織； 步驟7、將所述抗性愈傷組織轉移到分化再生培養基中分化成苗；和 步驟8、將步驟7所獲得的苗轉移到生根培養基中生根。2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述組織誘導培養基中[Ν03-]/[ΝΗ4+]=40mM/10mM ； 所述前篩選培養基中[N03-]/[NH4+] = 40mM/10mM;在所述分化再生培養基中[N03_]/[NH4+] = 40mM/10mM，并且含L 5mg/L萘乙酸(NAA)和lmg/L6_芐氨基嘌呤(6-BA);所述生根培養基中含0.4mg/L的萘乙酸。3.根據權利要求1所述的方法，其特征在于， 所述步驟I中的種子是成熟種子；和/或 所述步驟1、2中的誘導培養基包括:大量元素、B5微量元素、MS鐵鹽、B5維生素、500mg/L脯氨酸、500mg/L谷氨酰胺、300mg/L酪蛋白酶水解物、30g/L鹿糖、2mg/L2,4_ 二氯苯氧乙酸(2，4-D)、3g/L植物凝膠，該誘導培養基的pH為5.80 ;和/或 所述步驟3中的與農桿菌接觸是將愈傷組織浸泡在農桿菌懸浮液中；和/或所述步驟4中的農桿菌懸浮培養基包括:大量元素、B5微量元素、MS鐵鹽、B5維生素、500mg/L脯氨酸、500mg/L酪蛋白酶水解物、2mg/L2, 4_D、20g/L鹿糖、10g/L葡萄糖、100 μ mol/L乙酰丁香酮,該農桿菌懸浮培養...

【專利技術屬性】
技術研發人員：李浩，楊劍波，魏鵬程，楊亞春，倪大虎，李莉，倪金龍，陸徐忠，宋豐順，馬卉，秦瑞英，
申請(專利權)人：安徽省農業科學院水稻研究所，
類型：發明
國別省市：安徽;34