本發(fā)明專利技術(shù)提供了用于賦予針對(duì)細(xì)菌、植物、植物細(xì)胞、組織以及種子的殺蟲(chóng)活性的組合物和方法。提供了包括一種針對(duì)毒素多肽的編碼序列的組合物。這些編碼序列可以用在DNA構(gòu)建體或表達(dá)盒中用于在植物和細(xì)菌中進(jìn)行轉(zhuǎn)化和表達(dá)。組合物還包括經(jīng)轉(zhuǎn)化的細(xì)菌、植物、植物細(xì)胞、組織、以及種子。特別是提供了分離的毒素核酸分子。此外，包括相應(yīng)于這些多核苷酸的氨基酸序列，以及特異性結(jié)合到這些氨基酸序列上的抗體。具體而言，本發(fā)明專利技術(shù)提供了分離的核酸分子，這些核酸分子包括對(duì)SEQ?ID?NO：2或3中所示的氨基酸序列進(jìn)行編碼的核苷酸序列，或在SEQ?ID?NO：1中列出的核苷酸序列，連同它們的變體以及片段。
【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】
【國(guó)外來(lái)華專利技術(shù)】AXMI277線蟲(chóng)毒素及其使用方法相關(guān)申請(qǐng)的交叉引用本申請(qǐng)要求2011年6月30日提交的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)序列號(hào)61/503,132的權(quán)益，其內(nèi)容通過(guò)引用以其全文結(jié)合在此。電子提交的序列表的引用序列表的這個(gè)正式拷貝是通過(guò)EFS-Web以電子方式提交的一個(gè)ASCII格式序列表，文件命名為“2916693-094977-SEQLIST.txt”，創(chuàng)建于2012年6月28日，大小為21.4千字節(jié)，并且與本說(shuō)明書(shū)同時(shí)提交。包含在這個(gè)ASCII格式文件中的該序列表是本說(shuō)明書(shū)的一部分，并且通過(guò)引用以其全文結(jié)合在此。專利
本專利技術(shù)涉及分子生物學(xué)領(lǐng)域。提供了編碼殺蟲(chóng)蛋白的新穎的基因。這些蛋白質(zhì)和編碼它們的這些核酸序列在殺蟲(chóng)配制品的制備以及轉(zhuǎn)基因抗害蟲(chóng)植物的生產(chǎn)中是有用的。
技術(shù)介紹
蘇云金芽孢桿菌是一種形成革蘭氏陽(yáng)性孢子的土壤細(xì)菌，其特征在于它具有產(chǎn)生結(jié)晶內(nèi)含物的能力，這些結(jié)晶內(nèi)含物對(duì)某些目和物種的昆蟲(chóng)是具有特異毒性的，但是對(duì)植物以及其他非靶向的生物是無(wú)害的。由于這種原因，包括蘇云金芽孢桿菌菌株或它們的殺昆蟲(chóng)(insecticidal)蛋白的組合物可以用作環(huán)境可接受的殺蟲(chóng)劑來(lái)控制農(nóng)業(yè)的蟲(chóng)害或針對(duì)多種的人或動(dòng)物疾病的媒蟲(chóng)。來(lái)自蘇云金芽孢桿菌的晶體(Cry)蛋白(δ-內(nèi)毒素)具有主要針對(duì)鱗翅目的、半翅目的、雙翅目的、以及鞘翅目的幼蟲(chóng)的有效的殺昆蟲(chóng)活性。這些蛋白質(zhì)還已經(jīng)顯示對(duì)抗膜翅目、同翅目、虱目、食毛目、以及螨害蟲(chóng)目、連同其他無(wú)脊椎動(dòng)物目(如線蟲(chóng)動(dòng)物門(mén)、扁形動(dòng)物門(mén)、以及原生動(dòng)物門(mén)肉鞭毛蟲(chóng)亞門(mén))的活性(Feitelson(斐特爾森)(1993)TheBacillusThuringiensisfamilytree(蘇云金芽孢桿菌家族樹(shù)).在AdvancedEngineeredPesticides(《高級(jí)工程化殺蟲(chóng)劑》)中,MarcelDekker,Inc.(馬塞爾·德克公司),紐約市,紐約州)這些蛋白質(zhì)主要基于它們的殺昆蟲(chóng)活性最初被分類為CryI至CryV。這些主要的類別是鱗翅類特異的(I)、鱗翅類與雙翅目特異的(II)、鞘翅目特異的(III)、雙翅目特異的(IV)、以及線蟲(chóng)特異的(V)與(VI)。這些蛋白質(zhì)進(jìn)一步被分類為亞家族，每個(gè)家族之內(nèi)更加高度相關(guān)的蛋白質(zhì)被分配了分組字母，如Cry1A、Cry1B、Cry1C等。在每個(gè)組之內(nèi)的甚至更加緊密相關(guān)的蛋白質(zhì)被給予名稱，如Cry1C1，Cry1C2等。最近說(shuō)明了對(duì)于這些Cry基因的一種基于氨基酸序列同源性而不是昆蟲(chóng)靶標(biāo)特異性的新命名法(Crickmore(克里克莫爾)等人(1998)Microbiol.Mol.Biol.Rev.(《微生物分子生物學(xué)綜述》)62:807-813)。在這種新式分類中，每種毒素被分配了一個(gè)獨(dú)特的名稱，該名稱結(jié)合了一個(gè)第一列(一個(gè)阿拉伯?dāng)?shù)字)，一個(gè)第二列(一個(gè)大寫(xiě)體字母)、一個(gè)第三列(一個(gè)小寫(xiě)字母)、以及一個(gè)第四列(另一個(gè)阿拉伯?dāng)?shù)字)。在這種新式分類中，在該第一列中羅馬數(shù)字已經(jīng)換成了阿拉伯?dāng)?shù)字。具有小于45％的序列一致性的蛋白質(zhì)具有不同的第一列，并且對(duì)于第二和第三列的指標(biāo)對(duì)應(yīng)地是78％和95％。該晶體蛋白直到它已經(jīng)被昆蟲(chóng)攝取并且在昆蟲(chóng)的腸中溶解時(shí)才顯示出殺昆蟲(chóng)活性。被攝取的原毒素在昆蟲(chóng)的消化道中被蛋白酶水解為一種活性有毒分子(andWhiteley(1989)Microbiol.Rev.(《微生物綜述》)53:242-255)。這種毒素在該目標(biāo)幼蟲(chóng)的中腸中與頂端的刷狀緣受體相結(jié)合，并且插到該頂膜中產(chǎn)生了離子通道或孔，導(dǎo)致幼蟲(chóng)的死亡。δ-內(nèi)毒素總體上具有五個(gè)保守序列結(jié)構(gòu)域，以及三個(gè)保守結(jié)構(gòu)域(參見(jiàn)例如，deMaagd等人(2001)TrendsGenetics(《遺傳學(xué)趨勢(shì)》)17:193-199)。第一保守結(jié)構(gòu)域由7個(gè)α螺旋組成，并且參與膜插入與孔形成。結(jié)構(gòu)域II由排列成希臘鑰匙構(gòu)型的三個(gè)β折疊組成，并且結(jié)構(gòu)域III由“果凍卷餅”形式下的兩個(gè)反向平行β折疊組成(deMaagd等人,2001,同上)。結(jié)構(gòu)域II和III參與了受體識(shí)別和結(jié)合，并且因此被認(rèn)為是毒素特異性的決定簇。由于昆蟲(chóng)可以帶來(lái)的災(zāi)害，以及通過(guò)控制蟲(chóng)害在產(chǎn)量方面的改進(jìn)，存在著一種發(fā)現(xiàn)新形式的殺蟲(chóng)毒素的不斷需求。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
提供了用于賦予針對(duì)細(xì)菌、植物、植物細(xì)胞、組織以及種子的殺蟲(chóng)活性的組合物和方法。組合物包括針對(duì)殺蟲(chóng)(pesticidal)的和殺昆蟲(chóng)(insectidal)多肽的核酸分子編碼序列、包括那些核酸分子的載體、以及包括這些載體的宿主細(xì)胞。組合物還包括這些殺蟲(chóng)多肽序列以及針對(duì)那些多肽的抗體。這些核苷酸序列可以用在DNA構(gòu)建體或表達(dá)盒中以用于在多種生物(包括微生物和植物)中進(jìn)行轉(zhuǎn)化和表達(dá)。這些核苷酸或氨基酸序列可以是合成序列，這些合成序列已經(jīng)被設(shè)計(jì)為用于在一種生物中表達(dá)，該生物體包括但不局限于：一種微生物或一種植物。組合物還包括含有本專利技術(shù)的核苷酸序列的細(xì)菌、植物、植物細(xì)胞、組織以及種子。具體而言，提供了分離的核酸分子，這些核酸分子編碼一種殺蟲(chóng)蛋白。此外，涵蓋了與這些殺蟲(chóng)蛋白相對(duì)應(yīng)的氨基酸序列。具體而言，本專利技術(shù)提供了一種分離的或重組的核酸分子，該核酸分子包括對(duì)SEQIDNO:2或3中所示的氨基酸序列進(jìn)行編碼的核苷酸序列，或在SEQIDNO:1中列出的核苷酸序列，連同它們的生物活性的變體以及片段。還涵蓋了與本專利技術(shù)的一個(gè)核苷酸序列互補(bǔ)的核苷酸序列、或與本專利技術(shù)的一個(gè)序列雜交的核苷酸序列或其互補(bǔ)物。進(jìn)一步提供了載體、宿主細(xì)胞、植物以及種子，這些載體、宿主細(xì)胞、植物以及種子包括本專利技術(shù)的這些核苷酸序列，或?qū)Ρ緦＠夹g(shù)的這些氨基酸序列進(jìn)行編碼的核苷酸序列，連同它們的生物活性的變體以及片段。提供了用于產(chǎn)生本專利技術(shù)的多肽的方法，以及用于使用這些多肽來(lái)控制或殺死一種鱗翅目的、半翅目的、鞘翅目的、線蟲(chóng)目的、或雙翅目的害蟲(chóng)的方法。還包括了用于在一個(gè)樣品中檢測(cè)本專利技術(shù)的這些核酸和多肽的方法和試劑盒。本專利技術(shù)的這些組合物和方法對(duì)于產(chǎn)生具有增強(qiáng)的害蟲(chóng)抗性或耐受性的生物是有用的。這些生物以及包括這些生物的組合物對(duì)于農(nóng)業(yè)目的是所希望的。本專利技術(shù)的這些組合物還對(duì)于產(chǎn)生改變的或改進(jìn)的具有殺蟲(chóng)活性的蛋白質(zhì)、或?qū)τ谠诋a(chǎn)物或生物中檢測(cè)殺蟲(chóng)蛋白或核酸的存在是有用的。本專利技術(shù)描繪了用于調(diào)節(jié)生物(特別是植物或植物細(xì)胞)中的害蟲(chóng)抗性或耐受性的組合物和方法。“抗性”一詞是指該害蟲(chóng)(例如，昆蟲(chóng))一旦攝取或以其他方式接觸本專利技術(shù)的多肽類時(shí)就被殺死。“耐受性”一詞是指該害蟲(chóng)的運(yùn)動(dòng)、攝食、繁殖、或其他功能的損害或降低。這些方法涉及用編碼了本專利技術(shù)的一種殺蟲(chóng)蛋白的一個(gè)核苷酸序列來(lái)轉(zhuǎn)化生物。特別是，本專利技術(shù)的核苷酸序列對(duì)于制備具有殺蟲(chóng)活性的植物和微生物是有用的。因此，提供了經(jīng)轉(zhuǎn)化的細(xì)菌、植物、植物細(xì)胞、植物組織以及種子。組合物是桿菌或其他物種的殺蟲(chóng)的核酸以及蛋白質(zhì)。發(fā)現(xiàn)這些序列在用于隨后轉(zhuǎn)化入感興趣的生物體中的表達(dá)載體的構(gòu)建方面用作探針用于其他同源(或部分同源的)基因的分離，以及用于通過(guò)本領(lǐng)域中已知的方法(如，結(jié)構(gòu)域交換或DNA改組)來(lái)產(chǎn)生改變的殺蟲(chóng)蛋白，例如，采用內(nèi)毒素的Cry1、Cry2以及Cry9家本文檔來(lái)自技高網(wǎng)...
【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
一種重組核酸分子，包括一個(gè)核苷酸序列，該核苷酸序列編碼一個(gè)具有殺蟲(chóng)活性的氨基酸序列，其中所述核苷酸序列是選自下組，該組由以下各項(xiàng)組成：a)在SEQ?ID?NO:1中列出的核苷酸序列；b)一個(gè)編碼一種多肽的核苷酸序列，該多肽包括SEQ?ID?NO：2或3中任一者的氨基酸序列；c)一個(gè)編碼一種多肽的核苷酸序列，該多肽包括一個(gè)具有與SEQ?ID?NO：2或3中任一者的氨基酸序列至少95%的序列一致性的氨基酸序列。
【技術(shù)特征摘要】
【國(guó)外來(lái)華專利技術(shù)】1.一種重組核酸分子，由編碼氨基酸序列為SEQIDNO:2或3的殺蟲(chóng)多肽的核苷酸序列組成。
2.如權(quán)利要求1所述的重組核酸分子，其中，所述核苷酸序列如SEQIDNO:1所示。
3.如權(quán)利要求1所述的重組核酸分子，其中所述核苷酸序列是已經(jīng)被設(shè)計(jì)為用于在植物中表達(dá)的合成序列。
4.如權(quán)利要求1所述的重組核酸分子，其中所述核苷酸序列可操作地連接于能夠指導(dǎo)所述核苷酸序列在植物細(xì)胞中進(jìn)行表達(dá)的啟動(dòng)子。
5.一種載體，包括如權(quán)利要求1所述的重組核酸分子。
6.一種細(xì)菌宿主細(xì)胞，該細(xì)菌宿主細(xì)胞包含如權(quán)利要求1所述的重組核酸分子。
7.一種具有殺蟲(chóng)活性的重組多肽，該重組多肽由SEQIDNO:2或3的氨基酸序列組成。
8.一種組合物，包括如權(quán)利要求7所述的多肽。
9.如權(quán)利要求8所述的組合物，其中所述組合物選自粉末、粉塵、顆粒、噴霧、乳液、膠體以及溶液。
10.如權(quán)利要求9所述的組合物，其中所述顆粒為小粒。
11.如權(quán)利要求8所述的組合物，其中所述組合物通過(guò)細(xì)菌細(xì)胞培養(yǎng)物的干燥、均化、提取、過(guò)濾、離心、沉降或濃縮而制備。
12.如權(quán)利要求11所述的組合物，其中所述干燥為冷凍干燥。
13.如權(quán)利要求8所述的組合物，包括按重量計(jì)為1％至99％的所述多肽。
14.一種用于控制鱗翅目的、半翅目的、鞘翅目的、線蟲(chóng)目的或雙翅目的害蟲(chóng)種群的方法，包括將所述種群與殺蟲(chóng)有效量的如權(quán)利要求7所述的多肽進(jìn)行接觸。<...
【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：坎迪斯·普特，西奧多·W·卡恩，艾利薩·安東尼，
申請(qǐng)(專利權(quán))人：阿森尼克斯公司，
類型：發(fā)明
國(guó)別省市：美國(guó);US
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