本發明專利技術提供了一種構建體，其包含(i)編碼酪氨酸羥化酶(TH)的核苷酸序列，(ii)編碼GTP-環化水解酶I(CH1)的核苷酸序列和(iii)編碼芳香族氨基酸多巴脫羧酶(AADC)的核苷酸序列，其中編碼TH的核苷酸序列與編碼CH1的核苷酸序列相連，使得它們編碼融合蛋白TH-CH1。本發明專利技術還提供了包含所述核苷酸序列的病毒載體以及其在治療和/或預防帕金森氏病中的用途。
【技術實現步驟摘要】
【國外來華專利技術】構建體專利
本專利技術涉及一種包含編碼參與多巴胺合成途徑的酶活性的核苷酸序列的構建體。可操作地連接至少兩條核苷酸序列使得它們編碼一種融合蛋白。本專利技術也提供包含所述核苷酸序列的病毒載體基因組、載體生產系統和病毒載體顆粒。核苷酸序列在體內的表達，例如通過使用病毒載體顆粒的基因治療，導致多巴胺的合成，這在治療和/或預防以產生多巴胺的神經元的減少或損失為特征的神經系統疾病，如帕金森氏(Parkinson’ s disease)病中是有用的。專利技術背景帕金森氏病(PD)是一種神經變性疾病，其是以黑質區產多巴胺的神經元的損失為特征的。這最終導 致在紋狀體中多巴胺的耗竭，引起嚴重的運動障礙。帕金森氏病的一種治療方法是口服給藥L-D0PA，即多巴胺的前體，這可以恢復一定程度的運動功能。然而，隨著病情的發展，在運動障礙的治療中L-DOPA治療變得不那么有效，需要使用更高的劑量，這具有嚴重的副作用。可以通過將多巴胺直接釋放到紋狀體來實現ro的改善治療。這可以通過基因治療來實現。基因治療對于ro治療是有吸引力的，因為特定蛋白質的產生可以靶向cns(中樞神經系統)的特定區域，如紋狀體。從氨基酸酪氨酸的多巴胺合成涉及酶酪氨酸羥化酶(TH)，其催化從酪氨酸的L-DOPA合成，和芳香族氨基酸脫羧酶(AADC)，其將L-DOPA轉化為多巴胺。TH步驟被認為是限速的。TH發揮功能需要輔因子四氫生物蝶呤(BH4)，其合成是由酶GTP-環化水解酶I (CH-1)催化的。在ro動物模型中，已經研究了使用腺伴隨病毒(AAV)載體從多巴胺生物合成途徑遞送單一基因的基因治療方法具有一些行為益處(Leff等人，1999Neuroscience92，185-196 ；Bankiewicz 等人，2006Mol Therl4，564-570)。進一步的方法表明，在 PD 動物模型中同時遞送兩種或更多種介導多巴胺合成的酶表現出更大的功效(Fan等人，1998HumGene Ther9, 2527-2535.;Shen 等人，2000Hum Gene Therll, 1509-1519.;Muramatsu 等人，2002Hum Gene Ther13,345-354)。這導致了以下理論，如果所有三種多巴胺合成酶共同并在同一細胞中表達，那么多巴胺合成會更高，并會導致在ro中更有效。然而，由于AAV載體有限的包裝能力，可以被遞送的基因數量是有限的。因此，決定使用慢病毒載體(LV)用于此目的，因為這些載體的包裝容量要大得多。因為它們穩定轉導非分裂細胞類型，例如神經元的能力，慢病毒載體(LV)用于對中樞神經系統(CNS)的基因治療方法是特別有利的。已經開發了衍生自非靈長類慢病毒的，尚未知道對于人類是感染性或病原性的LV，如馬傳染性貧血病毒(EIAV)，而且確定了其轉導非分裂細胞的能力。PiOSmdn?是一種用于ro治療的基于馬傳染性貧血病毒(EIAV)的lv。ProSavin?的基因組是三順反子構建體,其包含由兩個內部核糖體進入位點(IRES)可操作地連接的三種關鍵的多巴胺合成酶，即TH、AADC和CHl的編碼序列。目前ProSavinit正在Ι/II期臨床試驗中進行評估，其中使用在包括三種質粒瞬時共轉染HEK293T 細胞的流程中產生的載體材料(Mitrophanous 等人，1999Gene Ther6,1808-1818)。任何基因治療方法的一個目標是提高載體的滴度，從而能使用體積更小的載體制備物。這在PraSavinfc型治療中是特別理想的結果，其中將所述載體直接注射到腦中，因此需要使用小體積。IRES元件的復雜二級結構可能成為有效逆轉錄的阻礙。因此，本專利技術人假設IRES元件的去除應該增加載體的滴度。其中一個方案是以編碼短肽序列(接頭)的序列取代IRES元件以產生包含多巴胺合成所需的三種酶活性中的兩種或更多種的融合蛋白。然而，因為TH的天然形式以同源四聚體存在(Goodwill等人，1997Nat Struct Biol4，578-585)，而CHl的天然形式以同源十聚體存在(Nar等人，1995Structure3,459-466 ；Steinmetz等人，1998J Mol Biol279，189-199)，這些酶彼此或與其它酶，如AADC的融合可能阻止了酶的正確的三級結構形成，然后這可能抑制酶的功能或阻止其以最大的能力發揮功能。支持這一點，先前已經報道，TH和β-半乳糖苷酶之間的融合是無酶活性的(Wu和C印ko (1994)，J Neurochem62:863-72)。令人驚奇的是，本專利技術人發現對于導致升高的L-DOPA和/或多巴胺產生水平的一些構建體，兩種或全部三種多巴胺合成酶的融合導致i)功能性酶；和ii)增強的多巴胺生物合成途徑。特別的是，與使用具有以IRES序列分隔的編碼多巴胺合成酶的全部三種基因的構建體獲得的水平相比時，對于一些構建體觀察到增強的多巴胺的產生。與預期相反，對于許多構建體，這些融合設計帶來的改善與載體滴度的增加設査關聯，表明IRES序列對滴度不具有抑制作用。此外，L-DOPA和多巴胺升高的水平并不是由于來自融合設計載體的蛋白表達的增加引起的，表明融合設計具有更高的比活性。 【附圖說明】圖1-編碼多巴胺酶融合體的基因組的示意圖。圖2-pONYK-TAiC的載體產量和HEK293T細胞中整合的載體的兒茶酚胺產量a) DNA整合分析評估載體滴度的結果b)HPLC分析評估兒茶酚胺產量的結果。圖3-載體和兒茶酚胺產量a) DNA整合分析評估載體滴度的結果b)HPLC分析評估HEK293T細胞中產量的結果。圖4-通過western印跡分析檢測產多巴胺通路中的蛋白。圖5-五個融合構建體的載體和兒茶酚胺產量a) DNA整合分析評估載體滴度的結果b)HPLC分析評估HEK293T細胞中兒茶酚胺產量的結果。圖6-通過western印跡分析檢測產多巴胺通路中的蛋白。a) Western印跡分析檢測TH的表達b) Western印跡分析檢測CHl的表達c) Western印跡分析檢測AADC的表達。圖7-顯示TH的截短形式通過GS15接頭與AADC連接的圖。圖8-通過western印跡分析檢測HEK293T轉導細胞的產多巴胺通路中的蛋白。a) Western印跡分析檢測TH的表達b) Western印跡分析檢測CHl的表達c) Western印跡分析檢測AADC的表達。*TH融合CHl的正確條帶的大小為68kDa，而且雖然在這些泳道中可以看到條帶，在這個大小在所有其它泳道中存在一條非特異性條帶。然而，條帶在強度上比非特異性條帶更暗。圖9-DNA整合分析評估未濃縮和濃縮的融合載體制備物的載體滴度的結果。圖10-以MOIl用EIAV載體轉導的紋狀體神經元a)經EIAV-GFP轉導的紋狀體神經元(MOIl)b)經載體轉導的紋狀體神經元的兒茶酚胺產量。圖1l-TCiAmod的載體產量和整合的載體的兒茶酚胺產量a) DNA整合分析評估載體滴度的結果b)HPLC分析評估HEK293T細胞中兒茶酚胺產量的結果。圖12 -用pONYKl、融合體和GFP載體對人原代皮質神經元的轉導a)來自以M0I2和10用EIAV-GFP載體轉導的人原代皮質神經元的圖像本文檔來自技高網...
【技術保護點】
一種構建體，其包含(i)編碼酪氨酸羥化酶(TH)的核苷酸序列，(ii)編碼GTP?環化水解酶I(CH1)的核苷酸序列和(iii)編碼芳香族氨基酸多巴脫羧酶(AADC)的核苷酸序列，其中編碼TH的核苷酸序列與編碼CH1的核苷酸序列相連，使得它們編碼融合蛋白TH?CH1。
【技術特征摘要】
【國外來華專利技術】2011.10.28 GB 1118636.8;2011.10.28 US 61/552,5811.一種構建體，其包含(i)編碼酪氨酸羥化酶(TH)的核苷酸序列，(ii)編碼GTP-環化水解酶I (CHl)的核苷酸序列和(iii)編碼芳香族氨基酸多巴脫羧酶(AADC)的核苷酸序列，其中編碼TH的核苷酸序列與編碼CHl的核苷酸序列相連，使得它們編碼融合蛋白TH-CHl。2.根據權利要求1所述的構建體，其選自:TH-L-CHl-壓JVADC ；AADC+TH+CH1 ；TH_l_CH1_l_AADC ;和TH_l_CH1_p_AADCL =接頭編碼序列， IRES =內部核糖體進入位點， P =啟動子。3.根據權利要求2所述的構建體，其是TH+CH1_ikes_AADC。4.根據前述權利要求中任一項所述的構建體，其包含不是為人類使用而密碼子優化的接頭。5.根據權利要求1-3任一項所述的構建體，其包含含有如SEQID N0.1所示序列的接頭。6.根據權利要求1或2所述的構建體，其具有序列AADC_u_TH+2_CH1或TH_u_AADC_u_CHl，其中LI和L2是兩個不同的接頭序列。7.根據權利要求6所述的構建體，其中LI和L2的核酸序列是不同的，但是LI和L2的氨基酸序列是相同的。8.根據權利要求7所述的構建體，其中LI和L2的核酸序列是不同的并選自SEQIDN0.1 和 SEQ ID N0.3。9.根據權利要求2所述的構建體，其具有序列TH+CH1_PJVADC，其中所述啟動子是組成型啟動子或組織特異性啟動子。10.根據權利要求9所述的構建體，其中所述啟動子是組成型啟動子，其是CMV啟動子、磷酸甘油酸激酶啟動子或胸苷激酶啟動子。11.一種病毒載體基因組，其包含根據前述權利要求中任一項所述的構建體。12.根據權利要求11所述的病毒載體基因組，其是慢病毒載體基因...
【專利技術屬性】
技術研發人員：K米特羅范奧斯，S拉爾夫，H斯圖爾德，A金斯曼，
申請(專利權)人：牛津生物醫學英國有限公司，
類型：發明
國別省市：英國;GB
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