與白菜黃色種皮基因Brsc?ye連鎖的SSR分子標記引物及應用制造技術

本發明專利技術公開了與白菜黃色種皮基因Brsc?ye連鎖的SSR分子標記引物及應用。該標記引物的獲得是以黃籽白菜和普通棕籽白菜及其F2分離群體的基因組DNA為模板，通過520對SSR引物對黃籽白菜親本和棕籽白菜親本進行多態性引物篩選，然后通過對F2群體的單株進行分析，篩選與白菜黃色種皮基因Brsc?ye連鎖的分子標記，成功獲得了與Brsc?ye基因連鎖的7對SSR標記引物，構建了白菜黃色種皮基因Brsc?ye的分子遺傳圖譜。連鎖分析發現Brsc?ye基因兩側連鎖緊密的兩個SSR標記的遺傳距離分別為0.17cM和0.29cM，該分子標記具有檢測方便，擴增穩定，重復性和準確率高等優點，為白菜、油菜黃色種皮性狀的分子輔助選擇育種提供依據，加快育種進程。

【技術實現步驟摘要】
與白菜黃色種皮基因Brsc-ye連鎖的SSR分子標記引物及應用
本專利技術屬于蔬菜育種及分子遺傳學領域，具體涉及與白菜黃色種皮基因Brsc-ye連鎖的SSR分子標記引物的開發及應用。
技術介紹
白菜(BrassicarapaL.)屬十字花科蕓薹屬蕓薹種白菜亞種，是起源于我國的主要蔬菜作物之一，也是世界三大油菜之一，與人們的日常生活密切相關，近年來，隨著人們生活水平的提高，人們對油料品質的要求日益高漲。因此，黃色種皮白菜育種受到越來越多國內外學者，育種家的重視。研究表明黃色種皮的油菜籽種皮薄，所以含油量高，不僅如此，黃色種皮油菜籽生產的油粗纖維含量較低，蛋白質含量較高，受到國內外的廣泛關注。但是，白菜種皮顏色需要開花結實且種子成熟后才能表現出，而且需要在田間逐株觀察，操作起來費時費力，極大的延緩了育種進程。因此為了加快黃籽白菜的育種速度，利用現代的分子生物技術，進行分子標記輔助育種十分必要。隨著分子生物學技術的快速發展，多種基于DNA多態性的分子技術應運而生，并廣泛應用于遺傳育種研究的各個領域。簡單序列重復(simplesequencerepeats，SSR)，又稱為微衛星DNA(microsatellite，DNA)，是一類由1-6個核苷酸串聯重復組成的DNA序列如(CA)n，(ATG)n，(TAGG)n等重復，其長度一般較短，廣泛分布于基因組的不同位置，由于重復次數的不同和重復程度的不完全造成了每個位點的多態性，包括SSR標記和EST-SSR標記兩種類型。其中，SSR標記具有共顯性、重復性好、多態性豐富、易于檢測等優點，已廣泛應用于植物遺傳多樣性分析、遺傳圖譜構建、基因定位和分子標記輔助育種等研究領域(Tautzand1994；Powelletal.，1996)。因此，基于以上SSR標記的優點，申請人利用白菜的測序結果，開發并成功篩選出與白菜種皮顏色基因Brsc-ye緊密連鎖的分子標記，并構建了Brsc-ye基因的分子遺傳圖譜，為克隆該基因及利用該分子標記進行黃籽油菜、白菜分子輔助育種，加快育種進程奠定了基礎。
技術實現思路
本專利技術的目的在于，提供一種與白菜種皮顏色基因Brsc-ye緊密連鎖的SSR分子標記引物，應用該SSR分子標記引物，通過PCR方法，在苗期即可鑒定區分黃籽白菜和棕籽白菜，從而淘汰非目標植株，大大提高選擇的效率。為了實現上述任務，本專利技術采用如下的技術解決方案：與白菜種皮顏色基因Brsc-ye連鎖的SSR分子標記引物，包括已鑒定出的7對SSR引物對中的一對，即可將黃色種皮與棕色種皮白菜區分開，同時使用兩個標記能提高選擇的準確性。7對SSR引物對的脫氧核糖核苷酸引物序列如下：引物對SSR309：上游引物(F)：5＇－ACACTTTCTTCCTCCTCCCTCTCT－3＇；下游引物(R)：5＇－CTCTCAACACTCCTCTCGTTTTCC－3＇；引物對SSR328：上游引物(F)：5＇－GAAGCCTGTTTGAACATTAC－3＇；下游引物(R)：5＇－ATCTCCATTAGTTACTACGC－3＇；引物對SSR282：上游引物(F)：5＇－ATAACAACACTAGGCGACAG－3＇下游引物(R)：5＇－CTCTGCTAACACTTCCCTCT－3＇引物對SSR289：上游引物(F)：5＇－GCTGGTTAGGTGGTGTTGGT－3＇下游引物(R)：5＇－GTGGTGCTTTGTCTTCGTCA－3＇引物對SSR298：上游引物(F)：5＇－GCTCCAGGTGTTACCATATT－3＇下游引物(R)：5＇－TATCACCCAAAGCAAAGGAC－3＇引物對SSR340：上游引物(F)：5＇－AACCTAATTTCGTGTTCATG－3＇下游引物(R)：5＇－AAAGACAGTACGCACAGACA－3＇引物對SSR344：上游引物(F)：5＇－TGTTGTGGTTCTGAAATGGA－3＇下游引物(R)：5＇－TGAAGATGGTGAATGAAGCC－3＇采用上述與白菜黃色種皮基因Brsc-ye緊密連鎖的SSR分子標記引物，通過DNA擴增，在苗期即可鑒定區分黃色種皮和棕色種皮白菜，從而淘汰非目標植株，大大提高選擇的效率。同時白菜黃色種皮基因Brsc-ye分子遺傳圖譜的構建可加快克隆該基因。所述的白菜黃色性狀輔助選擇的方法是：PCR擴增黃籽白菜基因組DNA的多態性片段，引物SSR309和SSR328分別產生大小約為252bp和109bp的產物，這兩個SSR標記分別位于Brsc-ye的兩側，與Brsc-ye的遺傳距離分別為0.17cM和0.29cM。本專利技術首次獲得了與白菜黃色種皮基因Brsc-ye最為緊密連鎖的分子標記引物，具有檢測方便，擴增穩定，重復性和準確率高等優點。其具體有益效果表現在：(1)獲得了在第6連鎖群(A06)上白菜黃色種皮基因Brsc-ye的分子遺傳圖譜，且首次獲得與Brsc-ye基因緊密連鎖的分子標記SSR309和SSR328，可在黃籽白菜分子標記輔助育種及Brsc-ye基因克隆中發揮重要的作用。(2)獲得了與Brsc-ye緊密連鎖的分子標記，并構建了其高密度遺傳圖譜。其中SSR328與Brsc-ye連鎖緊密，其遺傳距離為0.29cM，SSR309與Brsc-ye連鎖最為緊密，其遺傳距離為0.17cM，這兩個標記能夠幫助該基因向推廣品種中轉移以及與其他抗病、抗逆基因的聚合。(3)鑒定方便。這2個標記均為共顯性標記，具有擴增穩定、檢測方便、快速等優點。用這2個分子標記檢測Brsc-ye基因，可以確定Brsc-ye的存在與否及存在的狀態，進而快速篩選攜有Brsc-ye基因的植株，并用于黃籽白菜品種的選育。同時利用分子標記進行檢測時還可以避免環境對品種的影響，提高選擇的準確性。(4)提高黃籽白菜的選擇效率。在傳統的黃籽白菜鑒定過程中，必須等到白菜開花結實且種子成熟后才能對種皮顏色性狀進行觀察統計，因此黃籽白菜的選育不僅費時，而且難度大，成本高。用本專利技術的分子標記引物，通過檢查與白菜黃色種皮基因Brsc-ye緊密連鎖的分子標記，可將表型鑒定的工作大大減少，在苗期即可區分黃籽和棕籽白菜，從而淘汰非目標植株，因此，利用本專利技術的與Brsc-ye基因緊密連鎖的分子標記，不僅節約成本，而且大大的提高了育種效率，加快了育種進程。(5)可用于克隆白菜黃籽基因的研究。圖位克隆白菜黃籽基因Brsc-ye的前提在于獲得與Brsc-ye緊密連鎖的分子標記。SSR309和SSR328在所有已知的分子標記中與Brsc-ye連鎖最為緊密，為克隆該基因提供基礎。附圖說明圖1是白菜黃籽基因Brsc-ye的遺傳連鎖圖，右側為遺傳連鎖圖的標記，左側數據為標記間的遺傳距離(cM)。圖2是SSR309在黃籽和棕籽親本及F2代單株中的擴增結果；泳道信息：(從左到右)M，50bpDNAladder；BP是棕籽親本；YP是黃籽親本，7個純合棕籽單株；7個雜合棕籽單株；7個純合黃籽單株。圖3(a)棕籽材料92S105和(b)黃籽材料09Q5的種子。以下結合附圖和實施例對本專利技術作進一步的詳細說明。具體實施方式以下實施例中的實驗方法均為常規方法，所涉及的實驗試劑均為常規生化試劑。本專利技術的與白菜黃籽基因Brsc本文檔來自技高網...

【技術保護點】
與白菜黃色種皮基因Brsc?ye連鎖的SSR分子標記引物，其特征在于，與白菜黃色種皮基因Brsc?ye連鎖的兩對SSR分子標記引物如下：引物對SSR309，其脫氧核糖核苷酸引物序列為：上游引物(F)：5＇－ACACTTTCTTCCTCCTCCCTCTCT－3＇；下游引物(R)：5＇－CTCTCAACACTCCTCTCGTTTTCC－3＇；引物對SSR328，其脫氧核糖核苷酸引物序列為：上游引物(F)：5＇－GAAGCCTGTTTGAACATTAC－3＇；下游引物(R)：5＇－ATCTCCATTAGTTACTACGC－3＇。

【技術特征摘要】
1.一種白菜黃籽種皮基因克隆和白菜黃色種皮性狀輔助育種的方法，其特征在于，所述方法包括：與白菜黃色種皮基因Brsc-ye連鎖的分子標記引物SSR309和SSR328分別PCR擴增白菜基因組DNA，PCR擴增產物的的多態性片段大小分別為252bp和109bp，這兩個SSR標記分別位于Brsc-ye的兩側，與Brsc-ye的遺傳距離分別為0.17cM和0.29cM；所述引物SSR309脫氧核糖核苷酸引物序列為：上游引物(F)：5＇－ACACTTTCTTCCTCCTCCCTCTCT－3＇；下游引物(R)：5＇－CTCTCAACACTCCTCTCGTTTTCC－3＇；所述引物SSR328脫氧核糖核苷酸引物序列為：上游引物(F)：5＇－GAAGCCTGTTTGAACATTAC－3＇；下游引物(R)...

【專利技術屬性】
技術研發人員：張魯剛，任延靖，孫敬賢，吳俊清，趙靜，
申請(專利權)人：西北農林科技大學，
類型：發明
國別省市：陜西;61