檢測食源性致病菌的試劑盒及多重熒光PCR檢測方法技術

本發明專利技術新型公開了一種檢測食源性致病菌的試劑盒及多重熒光PCR檢測方法；該檢測食源性致病菌的試劑盒，其特征在于由以下組分組成：HRM反應預混液；dNTPs混合液；Taq聚合酶；上游引物；下游引物；熒光染料；DNA模版；水。本發明專利技術一種多重熒光PCR檢測方法，其特征在于包括以下步驟：提取樣品DNA；對樣品DNA進行多重熒光PCR擴增，擴增后對產物進行HRM分析后判定結果。本發明專利技術的目的是為了克服現有技術中的不足之處，提供一種操作簡便、快速，成本低的檢測食源性致病菌的試劑盒；本發明專利技術另一個目的是提供一種采用上述試劑盒的多重熒光PCR檢測主要食源性致病菌的方法，而且檢測結果準確。

【技術實現步驟摘要】
檢測食源性致病菌的試劑盒及多重熒光PCR檢測方法
本專利技術涉及一種檢測食源性致病菌的試劑盒及多重熒光PCR檢測方法；該檢測方法結核高分辨率熔解曲線HRM分析和熒光PCR技術，本方法可檢測沙門氏菌、金黃色葡萄球菌、副溶血性弧菌、單增李斯特菌及大腸桿菌O157:H7五種主要食源性致病菌中的一種或兩種以上至五種食源性致病菌，屬于微生物檢測領域。
技術介紹
2014年7月1日，國家衛計委發布的強制性食品安全標準“GB29921-2013《食品中致病菌限量》”正式實施，該標準涉及五種食源性致病菌，即本專利所述沙門氏菌、金黃色葡萄球菌、副溶血性弧菌、單增李斯特菌以及大腸桿菌O157:H7。其中，沙門氏菌(Salmonella)屬腸桿菌科，革蘭氏陰性腸道桿菌，已發現的近一千種。沙門氏菌病除可感染人外，還可感染很多動物，包括哺乳類、鳥、爬行類、魚、兩棲類及昆蟲。人畜感染后可呈無癥狀帶菌狀態，也可表現為有臨床癥狀的致死疾病。蛋、家禽和肉類產品是沙門氏菌病的主要傳播媒介，該病受威脅最大的是小孩、老年人及免疫缺陷個體。根據國際慣例，要求對易受沙門氏菌污染的食品進行分類管理，從而有效預防沙門氏菌病。副溶血弧菌(VibrioParahemolyticus)，是一種嗜鹽性細菌，系弧菌科弧菌屬，革蘭染色陰性。進食含有該菌的食物可食物中毒，也稱嗜鹽菌食物中毒，主要來自海產品。臨床上以急性起病、腹痛、嘔吐、腹瀉及水樣便為主要癥狀。副溶血性弧菌主要來源于魚、蝦、蟹、貝類和海藻等海產品。本病多在夏秋季發生于沿海地區，常造成集體發病。近年來由于海鮮空運，內地城市病例也漸增多。金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)是人類的一種重要病原菌，隸屬于葡萄球菌屬，有“嗜肉菌"的別稱，是革蘭氏陽性菌的代表，可引起許多嚴重感染。金黃色葡萄球菌在自然界中無處不在，空氣、水、灰塵及人和動物的排泄物中都可找到。因此，食品受到污染的機會很多。美國疾病控制中心報告，由金黃色葡萄球菌引起的感染占第二位。金黃色葡萄球菌腸毒素是個世界性衛生難題。金黃色葡萄球菌的流行病學一般有如下特點：季節分布，多見于春夏季；中毒食品種類多，如奶、肉、蛋、魚及其制品。此外，剩飯、油煎蛋、糯米糕及涼粉等引起的中毒事件也有報道。上呼吸道感染患者鼻腔帶菌率83％，所以人畜化膿性感染部位，常成為污染源。單增李斯特菌是是某些食物(主要是鮮奶產品)中的一種污染物，能引起嚴重食物中毒。也是一種人畜共患病的病原菌。感染后主要表現為敗血癥、腦膜炎和單核細胞增多。它廣泛存在于自然界中，食品中存在的單增李氏菌對人類的安全具有危險，該菌在4℃的環境中仍可生長繁殖，是冷藏食品威脅人類健康的主要病原菌之一。熒光PCR檢測技術大致分為兩大類：熒光探針法(標記熒光PCR)和非標記熒光染料法。前者則利用熒光標記的特異性探針或者引物來識別模板，優點是特異性更高，適用于擴增序列專一檢測，不過檢測成本高。后者主要是利用熒光染料與雙鏈DNA分子結合發光的特性來指示擴增產物的增加，無需另外合成探針，簡便易行，成本較低。相對以往普通非探針標記熒光PCR所用非飽和染料，新型飽和燃料(如LCGreen等)具有以下優點：①新型飽和染料對PCR反應沒有任何抑制作用。②DNA高溫變性時，非飽和熒光染料加入則會造成DNA雙鏈高溫變性時，單鏈部分的熒光染料分子發生遷移，熒光染料分子重新結合到雙鏈DNA的空置位點，造成熒光信號沒有變化，因此出現假陰性，特異性下降，而飽和染料則不會出現此類情況。③高溫穩定，對于高GC含量的PCR產物，在DNA雙鏈高溫熔解時，飽和熒光染料結合核酸更穩定。目前，食源性致病菌的檢測方法主要有傳統的培養方法和分子檢測方法。其中傳統的培養分離檢測方法，依賴于生化和形態學特點，我國以GB4789系列國家食品安全標準作為經典方法，規范了食源性致病菌傳統培養檢測方法，分子檢測方法則主要為SN/T1870-2007《食品中致病菌檢測方法實時PCR法》。但傳統培養法存在操作繁瑣、耗時長、易漏檢等缺點。分子檢測方法包括了常規PCR方法和探針法熒光PCR方法，常規PCR需要擴增后進行電泳，操作復雜且易引起污染。而探針法PCR則存在檢測成本很高，試劑保存期短等缺點。研究人員對此已開展了許多方法研究，但是同時針對這五種食源性致病菌開展多重熒光PCR檢測的研究尚未見報道
技術實現思路
本專利技術的目的是為了克服現有技術中的不足之處，提供一種操作簡便、快速，成本低的檢測食源性致病菌的試劑盒；本專利技術另一個目的是提供一種采用上述試劑盒的多重熒光PCR檢測主要食源性致病菌的方法，而且檢測結果準確。為了達到上述目的，本專利技術采用以下方案：一種檢測食源性致病菌的試劑盒，其特征在于由以下組分組成：如上所述的一種檢測食源性致病菌的試劑盒，其特征在于所述的上游引物包括沙門氏菌目的基因16sRNA上游引物SLMF：5‘-GGTGAAGGATTTAACCGTGAACTT-3’；所述下游引物包括沙門氏菌目的基因16sRNA上游引物SLMR：5‘-GCGCCTCGTTATCATCCAAAT-3’。如上所述的一種檢測食源性致病菌的試劑盒，其特征在于所述上游引物還包括金黃色葡萄球菌的目的基因16sRNA上游引物SPAF：5‘-CCTAATCAGAAAGCCACG-3’，所述下游引物還包括黃色葡萄球菌的目的基因16sRNA下游引物SPAR：5‘-AGTTTCCAATGACCCTCC-3’。如上所述的一種檢測食源性致病菌的試劑盒，其特征在于所述上游引物還包括副溶血性弧菌目的基因TLH上游引物VPF：5‘CAAACCAGCAAACACCTT-3’；所述下游引物還包括副溶血性弧菌目的基因TLH下游引物VPR：5‘GTCCGTCAAACGAATCAG-3’。如上所述的一種檢測食源性致病菌的試劑盒，其特征在于所述上游引物還包括單增李斯特菌目的基因16sRNA上游引物LMOF：5‘-ATCTAACCAGAAAGCCACG-3’，所述下游引物還包括單增李斯特菌目的基因16sRNA下游引物LMOR：5‘-GTTCCTCCACATATCTACGC-3’。如上所述的一種檢測食源性致病菌的試劑盒，其特征在于所述上游引物還包括大腸桿菌0157:H7目的基因rfbE上游引物O157F：5‘-GCTTTGTTAGCGTTAGGT-3’，所述下游引物還包括大腸桿菌0157:H7目的基因rfbE下游引物O157R：‘-GACATTTGCCAAGTTTCA-3’。本專利技術一種多重熒光PCR檢測方法，其特征在于包括以下步驟：A、提取樣品DNA；B、對樣品DNA進行多重熒光PCR擴增，其中在所述熒光定量PCR反應中所采用的反應液，包含下列成分：C、擴增后對產物進行HRM分析后判定結果。如上所述的一種多重熒光PCR檢測方法，其特征在于步驟B中對所有致病菌檢測時PCR擴增的反應程序按以下步驟進行：(1)92℃～96℃預變性30s；(2)92℃～96℃變性10～30s，55℃-63℃退火10～30s，72℃10～30s，共進行40～50個循環；(3)72℃延伸10～30s。如上所述的一種多重熒光PCR檢測方法，其特征在于步驟C中對PCR擴增產物進行HRM分析，按以下步驟進行：(1)92℃～96℃變性1本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種檢測食源性致病菌的試劑盒，其特征在于由以下組分組成：

【技術特征摘要】
1.一種食源性致病菌的檢測方法，其特征在于包括以下步驟：A、根據食源性致病菌設計引物對；B、提取樣本DNA后，利用設計的引物對進行熒光PCR擴增；其中所述樣本為食物樣品；C、應用帶HRM模塊的熒光定量PCR儀對PCR擴增產物進行HRM分析，確定擴增產物Tm值；其中步驟B中進行非標記熒光PCR擴增過程中的反應液由以下組分組成：所述的上游引物包括沙門氏菌目的基因16sRNA上游引物SLMF：5‘-GGTGAAGGATTTAACCGTGAACTT-3’；所述下游引物包括沙門氏菌目的基因16sRNA下游引物SLMR：5‘-GCGCCTCGTTATCATCCAAAT-3’；所述上游引物還包括金黃色葡萄球菌的目的基因16sRNA上游引物SPAF：5‘-CCTAATCAGAAAGCCACG-3’，所述下游引物還包括黃色葡萄球菌的目的基因16sRNA下游引物SPAR：5‘-AGTTTCCAATGACCCTCC-3’；所述上游引物還包括副溶血性弧菌目的基因TLH上游引物VPF：5‘CAAACCAGCAAACACCTT-3’；所述下游引物還包括副溶血性弧菌目的基因TLH下游引物VPR：5‘GTCCGTCAAACGAATCAG-3’；所述上游引物還包括單增李斯特菌目的基因16sRNA上游引物LMOF：5‘-ATCTAACCAGAAAGCCACG-3’，所述下游引物還包括單增李斯特菌...

【專利技術屬性】
技術研發人員：蔡先全，李蓉，邱德義，魚海瓊，柏建山，岳巧云，趙美轉，蕭綺倩，張磊，
申請(專利權)人：蔡先全，
類型：發明
國別省市：廣東;44