一種超高靈敏檢測(cè)凝血酶的比色法制造技術(shù)

本發(fā)明專利技術(shù)提供了一種超高靈敏檢測(cè)凝血酶的比色法。采用滾環(huán)復(fù)制放大技術(shù)，形成大量DNA酶，放大檢測(cè)信號(hào)，提高了凝血酶的檢測(cè)靈敏度。采用96孔板連接引物，可消除未反應(yīng)的hemin對(duì)反應(yīng)的影響，提高信噪比，進(jìn)一步提高檢測(cè)的靈敏度。采用靈敏的比色體系，利用過(guò)氧化氫將金離子還原成分散或團(tuán)聚狀態(tài)產(chǎn)生的紅色或藍(lán)色，直接判斷有無(wú)靶分子的存在，無(wú)需預(yù)先制備納米金溶液，簡(jiǎn)單易行，無(wú)需復(fù)雜儀器設(shè)備。通過(guò)本方法，可實(shí)現(xiàn)凝血酶的超高靈敏檢測(cè)，檢出限可達(dá)10-17M(約6個(gè)凝血酶分子)。

【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】

:本專利技術(shù)屬于生化分析
，特別涉及。
技術(shù)介紹
:凝血酶是一種蛋白水解酶，由兩條肽鏈組成，肽鏈之間以二硫鍵互相連接。凝血酶通過(guò)將血液中的纖維蛋白原轉(zhuǎn)化成纖維蛋白，加速血小板的凝聚，達(dá)到迅速止血的目的。癌癥患者腫瘤組織及腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移與擴(kuò)散，都會(huì)使患者的凝血機(jī)制發(fā)生變化，可以通過(guò)檢測(cè)凝血酶的濃度對(duì)癌癥等疾病進(jìn)行評(píng)估。目前檢測(cè)凝血酶的方法主要有熒光法、發(fā)色底物法及電化學(xué)法，但這三種方法的靈敏度均不佳，檢出限較高，無(wú)法達(dá)到現(xiàn)代醫(yī)學(xué)要求的痕量檢測(cè)；拉曼散射檢測(cè)生物分子具有較高的靈敏度，但操作復(fù)雜，需要昂貴的儀器，成本較高。目前常用比色法進(jìn)行檢測(cè)。比色法是通過(guò)比較或測(cè)量有色物質(zhì)溶液顏色深度來(lái)確定待測(cè)組分含量的方法。信號(hào)是溶液顏色的變化，可以肉眼檢測(cè)，簡(jiǎn)便快捷。專利200810036219.1提供了一種基于納米金與核酸結(jié)構(gòu)的靶分子檢測(cè)方法，有凝血酶存在時(shí)會(huì)與雙鏈探針中的核酸適體結(jié)合，釋放出的cDNA單鏈吸附到預(yù)先制備的納米金表面，從而提高納米金的耐鹽性，使溶液保持紅色，實(shí)現(xiàn)對(duì)凝血酶的檢測(cè)。但信號(hào)僅由加入的凝血酶產(chǎn)生，使體系檢出限較高。專利201210057638.X提供了一種基于滾環(huán)擴(kuò)增比色法檢測(cè)靶核酸或蛋白的方法，利用抗原抗體結(jié)合將待測(cè)靶核酸或蛋白通過(guò)捕獲抗體間接固定于磁珠上，通過(guò)雜交上的滾環(huán)引物進(jìn)行滾環(huán)擴(kuò)增，產(chǎn)生的大量重復(fù)序列的長(zhǎng)鏈DNA團(tuán)聚，表面負(fù)離子高度堆積，對(duì)納米金顆粒表面的負(fù)電荷有屏蔽作用，使納米金顆粒間排斥減弱，易發(fā)生聚集，使納米金溶液由酒紅色變紫黑色。該專利技術(shù)滾環(huán)復(fù)制的發(fā)生需要捕獲抗體、凝血酶、檢測(cè)抗體、引物探針和環(huán)形模板逐一連接，較為繁瑣且浪費(fèi)資源，且需要預(yù)先制備粒徑均一的納米金溶液，較為繁瑣。本專利技術(shù)無(wú)需預(yù)先制備納米金溶液，且只需要兩段核酸序列:環(huán)形模板circletemplate利用捕獲探針primer成環(huán)，捕獲探針primer同時(shí)作為引物，即可在成環(huán)的circletemplate上進(jìn)行滾環(huán)復(fù)制。本專利技術(shù)將核酸適體特異性識(shí)別凝血酶及滾環(huán)復(fù)制相結(jié)合，只需兩段核酸序列互相連接，在進(jìn)行滾環(huán)復(fù)制放大信號(hào)的基礎(chǔ)上，將核酸適體特異性結(jié)合凝血酶的原理與金-過(guò)氧化氫變色體系相結(jié)合。當(dāng)過(guò)氧化氫存在時(shí)，會(huì)將金離子還原成納米金，高濃度的過(guò)氧化氫有助于形成分散的、球形的納米金，使溶液顯紅色；當(dāng)滾環(huán)復(fù)制反應(yīng)生成DNA酶后，DNA酶可催化過(guò)氧化氫分解，使過(guò)氧化氫濃度降低，則形成團(tuán)聚的納米金，使溶液顯藍(lán)色。該方法無(wú)需預(yù)先制備納米金溶液，省時(shí)省力，且極大地提高了檢測(cè)靈敏度，該專利技術(shù)的檢出限可達(dá)10_17M(約6個(gè)凝血酶分子)，實(shí)現(xiàn)了凝血酶的超高靈敏分析檢測(cè)。DNA酶是一種具有催化活性的DNA分子，具有蛋白酶的催化性能。蛋白酶在高溫、強(qiáng)酸或強(qiáng)堿條件下會(huì)因?yàn)榘l(fā)生不可逆變性而失活，因此使用條件較為苛刻；而DNA酶在具有蛋白酶的催化性能的同時(shí)，不會(huì)因?yàn)闇囟取H等條件的改變而發(fā)生不可逆變性，因此得到了越來(lái)越廣泛的關(guān)注。滾環(huán)復(fù)制是噬菌體感染細(xì)菌后進(jìn)行自我復(fù)制所采取的一種形式，是以封閉的單鏈環(huán)狀DNA作為模板，當(dāng)有相應(yīng)的與之堿基互補(bǔ)雜交的引物存在時(shí)，在等溫的環(huán)境下進(jìn)行復(fù)制擴(kuò)增。通過(guò)這種復(fù)制方式，環(huán)狀單鏈DNA能夠?qū)崿F(xiàn)相對(duì)無(wú)限的單鏈擴(kuò)增。該方法不需要對(duì)模板DNA樣品進(jìn)行特殊處理，實(shí)現(xiàn)信號(hào)的高效放大。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
:為了解決上述問(wèn)題，我們采用滾環(huán)復(fù)制放大技術(shù)，形成大量DNA酶，放大檢測(cè)信號(hào)，提高了凝血酶的檢測(cè)靈敏度。采用96孔板連接引物，可消除未反應(yīng)的氯化血紅素(hemin)對(duì)反應(yīng)的影響，提高信噪比，進(jìn)一步提高檢測(cè)的靈敏度。采用靈敏的比色體系，利用過(guò)氧化氫將金離子還原成分散或團(tuán)聚狀態(tài)產(chǎn)生的紅色或藍(lán)色，直接判斷有無(wú)靶分子的存在，無(wú)需預(yù)先制備納米金溶液，簡(jiǎn)單易行，無(wú)需復(fù)雜儀器設(shè)備。通過(guò)本方法，可實(shí)現(xiàn)凝血酶的超高靈敏檢測(cè)，檢出限可達(dá)KT17M(約6個(gè)凝血酶分子)。為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本專利技術(shù)采用以下技術(shù)方案:，包括如下步驟:I)在細(xì)胞培養(yǎng)板表面包被戊二醛，通過(guò)共價(jià)方法固定捕獲探針primer鏈；2)設(shè)計(jì)環(huán)形模板circle template，其可與凝血酶特異性結(jié)合，結(jié)合后阻擋滾環(huán)復(fù)制的繼續(xù)；3)加入DNA連接酶，使上述的環(huán)形模板circle template在細(xì)胞培養(yǎng)板表面的primer鏈上成環(huán)；4)加入摩爾數(shù)為上述primer的0-1(Γη倍的待測(cè)液，通過(guò)DNA聚合酶作用進(jìn)行滾環(huán)復(fù)制擴(kuò)增反應(yīng)；5)加入摩爾數(shù)為上述primer的2-10倍的hemin，形成G-四鏈體DNA酶；6)依次加入過(guò)氧化氫和氯金酸溶液，反應(yīng)后觀察溶液顏色變化并測(cè)吸光度。優(yōu)選的是，步驟I)中，所述的細(xì)胞培養(yǎng)板為96孔板。優(yōu)選的是，步驟I)中，所述的捕獲探針primer鏈，其核苷酸序列為Y -GACGGCGAA GGA TTG ATA CT-3'，5'端氨基修飾。優(yōu)選的是，步驟2)中，所述環(huán)形模板circle template，其核苷酸序列中包括GG TTGG TGT GG TT GG 段。優(yōu)選的是，步驟2)中，所述環(huán)形模板circle template，其核苷酸序列為5' -CTTCGC CGT CCC CAA CCC GCC CTA CCC GGT TGG TGT GGT TGG CCC AAC CCG CCC TAC CCA GTATCA ATC-3'。優(yōu)選的是，步驟3)中，所述DNA連接酶為T4連接酶。優(yōu)選的是，步驟4)中，所述DNA聚合酶為phi29DNA聚合酶。優(yōu)選的是，步驟5)中，形成G-四鏈體DNA酶的條件為25°C反應(yīng)1_1.5h。優(yōu)選的是，步驟6)中，所述過(guò)氧化氫的摩爾數(shù)為上述primer的14倍。優(yōu)選的是，步驟6)中，所述氯金酸的摩爾數(shù)為上述primer的100倍。凝血酶的檢測(cè)原理:當(dāng)有凝血酶存在時(shí)，凝血酶會(huì)與circle template形成的DNA環(huán)特異性結(jié)合，阻止?jié)L環(huán)復(fù)制的發(fā)生，無(wú)法形成滾環(huán)復(fù)制產(chǎn)物與hemin結(jié)合生成DNA酶，進(jìn)而無(wú)法催化過(guò)氧化氫的分解。因此過(guò)氧化氫足量，能使金還原成分散良好的狀態(tài)，顯紅色；而當(dāng)沒(méi)有凝血酶存在時(shí)，無(wú)法阻止?jié)L環(huán)復(fù)制的發(fā)生，滾環(huán)復(fù)制產(chǎn)物與hemin結(jié)合后生成的大量DNA酶將過(guò)氧化氫分解，將金還原成團(tuán)聚的狀態(tài)，顯藍(lán)色。本專利技術(shù)的有益技術(shù)效果:1.本專利技術(shù)提供了。采用滾環(huán)復(fù)制放大技術(shù)，形成大量DNA酶，放大檢測(cè)信號(hào)，提高了凝血酶的檢測(cè)靈敏度。采用96孔板連接引物，可消除未反應(yīng)的hemin對(duì)反應(yīng)的影響，提高信噪比，進(jìn)一步提高檢測(cè)的靈敏度。采用靈敏的比色體系，利用過(guò)氧化氫將金離子還原成分散或團(tuán)聚狀態(tài)產(chǎn)生的紅色或藍(lán)色，直接判斷有無(wú)靶分子的存在，無(wú)需預(yù)先制備納米金溶液，簡(jiǎn)單易行，無(wú)需復(fù)雜儀器設(shè)備。通過(guò)本方法，可實(shí)現(xiàn)凝血酶的超高靈敏檢測(cè)，檢出限可達(dá)10_17M(約6個(gè)凝血酶分子)。2.其circle template鏈為富C堿基的序列，成環(huán)后，引物以環(huán)為模板進(jìn)行滾環(huán)復(fù)制，產(chǎn)物為一條富G堿基的序列，該富G序列與hemin通過(guò)電子堆積作用結(jié)合，形成G-四鏈體DNA酶，可以催化過(guò)氧化氫的分解。滾環(huán)復(fù)制可使該富G序列無(wú)限延長(zhǎng)，極大地增大DNA酶的量，進(jìn)而放大檢測(cè)信號(hào)。【附圖說(shuō)明】圖1凝血酶與DNA環(huán)特異性結(jié)合電泳表征圖圖2不同濃度凝血酶的檢測(cè)靈敏度圖3不同濃度凝血酶反應(yīng)后，溶液在540nm處光吸收的變化規(guī)律圖4凝血酶、牛血清白本文檔來(lái)自技高網(wǎng)...

【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
一種超高靈敏檢測(cè)凝血酶的比色法，其特征在于，包括如下步驟：1)在細(xì)胞培養(yǎng)板表面包被戊二醛，通過(guò)共價(jià)方法固定捕獲探針primer鏈；2)設(shè)計(jì)環(huán)形模板circle?template，其可與凝血酶特異性結(jié)合，結(jié)合后阻擋滾環(huán)復(fù)制的繼續(xù)；3)加入DNA連接酶，使上述的環(huán)形模板circle?template在細(xì)胞培養(yǎng)板表面的primer鏈上成環(huán)；4)加入摩爾數(shù)為上述primer的0?10?11倍的待測(cè)液，通過(guò)DNA聚合酶作用進(jìn)行滾環(huán)復(fù)制擴(kuò)增反應(yīng)；5)加入摩爾數(shù)為上述primer的2?10倍的hemin，形成G?四鏈體DNA酶；6)依次加入過(guò)氧化氫和氯金酸溶液，反應(yīng)后觀察溶液顏色變化并測(cè)吸光度。

【技術(shù)特征摘要】

【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：王宗花，王賽，畢賽，夏建飛，張菲菲，楊敏，桂日軍，李延輝，夏延致，
申請(qǐng)(專利權(quán))人：青島大學(xué)，
類型：發(fā)明
國(guó)別省市：山東;37