一種基于核酸適體的比色法檢測阿爾茨海默癥標志物Aβ寡聚體的探針的構建方法技術

本發明專利技術公開了一種基于核酸適體的比色法檢測阿爾茨海默癥標志物的方法，該方法是：將阿爾茨海默癥標志物適體修飾在納米金表面，得到探針；將一系列不同濃度的Aβ寡聚體標準液先分別與所述探針反應，再分別與NaCl溶液反應，反應液通過紫外檢測納米金聚集態及分散態的紫外吸收峰值，建立Aβ寡聚體濃度值對應納米金聚集態紫外吸收峰值和納米金分散態紫外吸收峰值比率的標準曲線，對待測液進行檢測并依據標準曲線進行分析，即得待測液中Aβ寡聚體的濃度；該方法能實現阿爾茨海默癥標志物濃度的檢測，且具有穩定性好、成本低、快速的優點。

Method for detecting Alzheimer's disease marker by colorimetric method based on aptamer

The invention discloses an aptamer colorimetric method to detect Alzheimer's disease marker based method, the method is: Alzheimer's disease marker aptamer modified by the probe on the surface of gold nanoparticles,; a series of different concentrations of A beta oligomers were standard solution and the probe reaction, then with NaCl solution, reaction solution by ultraviolet UV detection of gold nanoparticles aggregation and dispersion of the absorption peak, the establishment of A beta oligomer concentration standard curve dispersed gold nanoparticles aggregation corresponding ultraviolet UV absorption peak and absorption peak of gold nanoparticles treated liquid ratio, and on the basis of standard curve detection that is to be analyzed, concentration of solution in A beta oligomers; this method can realize the detection of Alzheimer's disease biomarker concentrations, and has the advantages of good stability, low cost, fast.

【技術實現步驟摘要】

本專利技術涉及一種檢測阿爾茨海默癥標志物的方法，特別涉及一種基于核酸適體的比色法檢測阿爾茨海默癥標志物的方法；屬于生物納米領域。
技術介紹
阿爾茨海默癥已經成為二十一世紀威脅人類健康的重大疾病之一，它是一種退行性疾病，特點為逐步認知能力下降，不可逆的有害的障礙以及可觀察到的記憶障礙。阿爾茨海默癥患者腦內有老年斑沉積，Aβ淀粉樣蛋白是老年斑的主要成分，因此可以通過檢測Aβ淀粉樣蛋白來預估老年癡呆的程度，同時據研究發現，Aβ寡聚體對神經元突觸有毒害作用，而且在阿爾茨海默癥患者腦脊液中的含量明顯比正常人中的含量高。因此專利技術一種能快速檢測Aβ寡聚體的含量，且靈敏性高，易于操作，并能特異性識別Aβ寡聚體的方法就顯得尤為重要。目前存在的電化學，熒光，SPR檢測Aβ的方法，均有其優勢也有其劣勢，有效性，易于操作，無輻射是共有的優勢，但由于Aβ物種通常為Aβ單體，Aβ寡聚體，Aβ聚集體的混合物，如果檢測方法不能準確的識別Aβ寡聚體，會使其靈敏性降低，而且對于電化學方法不夠具有時效性。同時目前也有通過計算機技術來檢測Aβ寡聚體的方法，但是由于缺少分子平臺，所以它對于設計一個分子在Aβ物種中檢測Aβ寡聚體仍然是一個巨大的挑戰。
技術實現思路
針對現有技術存在的缺陷，本專利技術的目的是在于提供一種操作簡單、快速、低成本的通過比色法檢測Aβ寡聚體的方法。為了實現上述技術目的，本專利技術提供了一種基于核酸適體的比色法檢測阿爾茨海默癥標志物的方法，該方法包括以下步驟：1)通過檸檬酸鈉還原氯金酸制備納米金；2)將阿爾茨海默癥標志物適體修飾在所述納米金表面，得到探針；3)將一系列不同濃度的Aβ寡聚體標準液先分別與所述探針反應，再分別與NaCl溶液反應，各所得反應液分別通過紫外檢測納米金聚集態及分散態的紫外吸收峰值，建立Aβ寡聚體濃度值對應納米金聚集態紫外吸收峰值和納米金分散態紫外吸收峰值比率的標準曲線；4)將含Aβ寡聚體的待測液按3)步驟通過紫外檢測并依據標準曲線分析，即得待測液中Aβ寡聚體的濃度。本專利技術的技術方案，主要是基于納米金處于分散狀態時，在522nm處有其獨特的吸收峰，而當納米金聚集時，其吸收峰會紅移的特點。納米金在濃度較高的氯化鈉濃度中，會聚集成聚集態，其在696nm處出現吸收峰，從而會發生變色反應(溶液顏色也會隨之由酒紅色變成藍色)。而本專利技術的技術方案，將阿爾茨海默癥標志物適體修飾在納米金上構成探針，當阿爾茨海默癥標志物存在時，會與納米金表面修飾的阿爾茨海默癥標志物適體結合，形成G-四聯體結構，使得納米金的耐鹽性增強，從防止納米金聚集，因此可以通過紫外測定待測液中納米金聚集態696nm處吸收峰值與納米金522nm處吸收峰值的比值，可以實時表征標志物的濃度。優選的方案，納米金尺寸為13nm～15nm。較優選的方案，所述的納米金的制備過程為：將濃度為0.005～0.015wt％氯金酸溶液加熱至沸騰后，加入濃度為1.5～2.5wt％的檸檬酸鈉溶液進行反應，直至反應液變成酒紅色后，保持反應液沸騰15～20分鐘，冷卻至室溫，即得納米金；其中，氯金酸與檸檬酸鈉的質量比為1:3～5。優選的方案，將阿爾茨海默癥標志物適體與納米金在室溫下反應，得到探針。較優選為：將阿爾茨海默癥標志物適體與納米金按(350～450)nM:2nM的比例，在25℃～40℃溫度下反應10～15分鐘，得到探針。優選的技術方案中，探針表面的阿爾茨海默癥標志物適體修飾量易于調控。可以通過簡單調節孵育過程中阿爾茨海默癥標志物適體濃度，以及適體與納米金的反應比例，來實現適體在納米金表面的結合量，易于使適體在納米金表面的結合量達到最大化。優選的方案，將濃度為0.01μM、0.05μM、0.1μM、0.5μM、0.75μM、2.5μM、5μM、10μM、20μM和40μM的Aβ寡聚體標準液分別與探針反應30～60min，再分別與170～180mM的NaCl溶液反應5～10min后，分別采用紫外檢測Aβ寡聚體標準溶液中納米金聚集態及分散態的紫外吸收峰值，并建立Aβ寡聚體濃度值對應納米金聚集態紫外吸收峰值和納米金分散態紫外吸收峰值比率的標準曲線。優選的方案，阿爾茨海默癥標志物適體為AβOligomer對應的適體。本專利技術的方法采用阿爾茨海默癥標志物適體來作用于相應的Aβ寡聚體蛋白，具有更高的特異性和識別力，檢測的靈敏度更高。本專利技術方案中采用的阿爾茨海默癥標志物適體可以通過現有的常規方法篩選方法獲得，或者直接通過購買得到，如生工生物工程上海(股份)有限公司。本專利技術方案中采用的阿爾茨海默癥標志物適體無任何修飾，主要通過靜電力吸附結合于制備的納米金表面。相對現有技術，本專利技術技術方案帶來的有益技術效果：1)本專利技術的技術方案構建的探針采用的是阿爾茨海默癥標志物對應的適體，沒有干擾物質，檢測限低，具有特異性識別，檢測靈敏度更高。2)本專利技術的技術方案探針的制備及用于Aβ寡聚體的檢測過程簡單、重復性好。探針僅采用一種核酸分子鏈，且無修飾成分，相對于使用具有巰基，信號分子等修飾的適體而言，成本很低。3)本專利技術的構建的探針為納米金與適體的復合物，適體直接捕捉目標物，因此可直接用來檢測標志物。4)本專利技術的技術方案以阿爾茨海默癥標志物適體(aptamer)來作用于阿爾茨海默癥標志物，同時根據溶液的紫外曲線來分析阿爾茨海默癥標志物的含量，具有靈敏度高、檢出限低、特異性強的特點。5)本專利技術技術方案采用的適體序列可變，適體更換序列后可以推廣到檢測相對應的其他標志物，如多肽，DNA，RNA，使得傳感器能得到更廣泛的應用，具有一定的普遍性。附圖說明【圖1】為本專利技術檢測阿爾茨海默癥標志物的原理示意圖；【圖2】為制備的納米金的透射電子顯微鏡圖；【圖3】為檢測不同濃度標志物的紫外圖；【圖4】為特定鹽濃度下，探針溶液透射電子顯微鏡圖；【圖5】為特定鹽濃度下，加入了一定濃度AβOligomer后的透射電子顯微鏡圖；【圖6】為通過紫外檢測Aβ寡聚體標準液建立Aβ寡聚體濃度值對應納米金聚集態紫外吸收峰值和納米金分散態紫外吸收峰值比率(A696/A522)的標準曲線。具體實施方式以下實施例旨在進一步說明本
技術實現思路
，而不是限制本專利技術權利要求的保護范圍。實施例1(1)納米金制備，及其納米金與適體結合制備探針，步驟如下：首先將100mL 0.01％氯金酸在攪拌下，加熱至沸騰，然后迅速往沸騰的溶液中加入2mL 2％檸檬酸鈉溶液，繼續攪拌使之混合均勻，此時攪拌不宜過于劇烈，以免混合不均勻，同時保持繼續沸騰狀態，當顏色由無色轉為酒紅色時，開始計時，繼續加熱15min，然后把溶液從油浴鍋中拿出，放置磁力攪拌器上攪拌冷卻至室溫，然后利用紫外分光光度計以及粒徑分析儀進行納米金溶液粒子尺寸和分散程度的表征。(2)納米金與適體結合將阿爾茨海默癥標志物適體與納米金在室溫下反應10-15分鐘，得到探針。阿爾茨海默癥標志物適體與納米金的比例為400nM:2nM。(3)建立標準曲線：分別配制不同濃度(0.01,0.05,0.1,0.5,0.75,2.5,5,10,20,40μM)的AβOligomer，分別依次加入到以上構建的納米金與適體構成的探針溶液中，由于探針溶液中的適體是對應的AβOligomer的aptamer，它能夠和AβOligomer形成穩定本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種基于核酸適體的比色法檢測阿爾茨海默癥標志物的方法，其特征在于：包括以下步驟：1)通過檸檬酸鈉還原氯金酸制備納米金；2)將阿爾茨海默癥標志物適體修飾在所述納米金表面，得到探針；3)將一系列不同濃度的Aβ寡聚體標準液先分別與所述探針反應，再分別與NaCl溶液反應，各所得反應液分別通過紫外檢測納米金聚集態及分散態的紫外吸收峰值，建立Aβ寡聚體濃度值對應納米金聚集態紫外吸收峰值和納米金分散態紫外吸收峰值比率的標準曲線；4)將含Aβ寡聚體的待測液按3)步驟通過紫外檢測，并依據標準曲線進行分析，即得待測液中Aβ寡聚體的濃度。

【技術特征摘要】
1.一種基于核酸適體的比色法檢測阿爾茨海默癥標志物的方法，其特征在于：包括以下步驟：1)通過檸檬酸鈉還原氯金酸制備納米金；2)將阿爾茨海默癥標志物適體修飾在所述納米金表面，得到探針；3)將一系列不同濃度的Aβ寡聚體標準液先分別與所述探針反應，再分別與NaCl溶液反應，各所得反應液分別通過紫外檢測納米金聚集態及分散態的紫外吸收峰值，建立Aβ寡聚體濃度值對應納米金聚集態紫外吸收峰值和納米金分散態紫外吸收峰值比率的標準曲線；4)將含Aβ寡聚體的待測液按3)步驟通過紫外檢測，并依據標準曲線進行分析，即得待測液中Aβ寡聚體的濃度。2.根據權利要求1所述的基于核酸適體的比色法檢測阿爾茨海默癥標志物的方法，其特征在于：所述的納米金尺寸為13nm～15nm。3.根據權利要求1或2所述的基于核酸適體的比色法檢測阿爾茨海默癥標志物的方法，其特征在于：所述納米金的制備過程為：將濃度為0.005～0.015wt％氯金酸溶液加熱至沸騰后，加入濃度為1.5～2.5wt％的檸檬酸鈉溶液進行反應，直至反應液變...

【專利技術屬性】
技術研發人員：鄧春艷，劉慧，向娟，錢頻，
申請(專利權)人：中南大學，
類型：發明
國別省市：湖南;43