抗TNFα的全人源單克隆抗體及其應(yīng)用制造技術(shù)

本發(fā)明專(zhuān)利技術(shù)屬于抗體藥物的技術(shù)領(lǐng)域，提供抗TNFα的全人單克隆抗體及其應(yīng)用，這些抗體是來(lái)源于人雜交瘤并經(jīng)過(guò)細(xì)胞毒功能測(cè)試篩選和通過(guò)噬菌體展示技術(shù)進(jìn)行親和力篩選獲得的，具有對(duì)TNFα的優(yōu)異的親和力和特異性。在細(xì)胞模型的藥效學(xué)試驗(yàn)中，這些抗體能夠有效中和TNFα及其所產(chǎn)生的細(xì)胞學(xué)效應(yīng)。在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，這些抗體同樣能有效中和TNFα，并抑制動(dòng)物模型中TNFα所帶來(lái)的表型。其效果顯示不低于或比Humira更好。

【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】

本專(zhuān)利技術(shù)涉及抗體藥物的
具體地說(shuō)，涉及一組新的全人源單克隆抗體分 子，其可用于治療TNFa引起的疾病治療。
技術(shù)介紹
眾所周知，腫瘤壞死因子（tumornecrosis factor,TNF)家族參與各種免疫和炎癥 反應(yīng)的調(diào)控，是自身免疫性疾病（autoimmune disease)的關(guān)鍵性細(xì)胞因子。自身免疫性疾 病是指機(jī)體對(duì)自身抗原發(fā)生免疫反應(yīng)而導(dǎo)致自身組織損害所引起的疾病。常見(jiàn)的系統(tǒng)性自 身免疫病有：類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、強(qiáng)直性脊柱炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、口眼干燥綜合征、硬皮病、 結(jié)節(jié)性多動(dòng)脈炎、Wegener肉芽腫病。TNF參與類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（RA)復(fù)雜的細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)反應(yīng)，調(diào) 節(jié)炎癥反應(yīng)，因而針對(duì)TNF治療RA及其他自身免疫疾病在理論上是有效的。事實(shí)上，大樣 本多中心臨床試驗(yàn)證明 ，抗TNF治療能明顯改善RA的癥狀，減輕疾病活動(dòng)。 (一）TNF蛋白結(jié)構(gòu) 人TNF- α基因定位在染色體6q21. 3區(qū)域，與主要組織相容性抗原復(fù)合體III類(lèi) 基因（MHC-III)緊密連鎖。基因組全長(zhǎng)3kb (含4個(gè)外顯子和3個(gè)內(nèi)含子），成熟產(chǎn)物由157 個(gè)氨基酸組成，80%的氨基酸序列由第4個(gè)外顯子編碼。TNF-α是一個(gè)非螺旋、富含β折 疊的蛋白多肽，每個(gè)單體由反向平行的β折疊組成，通常以二聚體、三聚體或五聚體的形 式存在于體內(nèi)，具有生物學(xué)活性的TNF-α分子是緊密連接的三聚體。 1984年從HL-60、U937等細(xì)胞中克隆成功rHu TNF- a cDNA，并在大腸桿菌中獲得 高表達(dá)。人TNF-α前體由233個(gè)氨基酸殘基組成，含76個(gè)氨基酸殘基的信號(hào)肽，切除信號(hào) 肽后成熟型TNF-α為157氨基酸殘基，非糖基化，第69位和101位兩個(gè)半胱氨酸形成分子 內(nèi)二硫鍵。rHu TNF-α分子量為17kDa。小鼠 TNF-α前體為235氨基酸殘基，信號(hào)肽79 氨基酸殘基，成熟的小鼠 TNF-a (rMuTNF-α )分子量為17kDa，由156個(gè)氨基酸殘基組成， 第69位和100位兩個(gè)半胱氨酸形成分子內(nèi)二硫鍵，有一個(gè)糖基化點(diǎn)，但糖基化不影響其生 物學(xué)功能。rHu TNF-α與rMu TNF-α有79 %氨基酸組成同源性，TNF-α的生物學(xué)作用似 無(wú)明顯的種屬特異性。 TNF- α基因是RA發(fā)病遺傳因素的一個(gè)重要候選基因，TNF增強(qiáng)子238為GG基因 型于RA進(jìn)展性關(guān)節(jié)破壞程度相關(guān)且不依賴(lài)于DR4的存在。此外有研究發(fā)現(xiàn) ，TNF區(qū)域多 態(tài)性可能于DR等位基因存在交互作用從而影響疾病易感性。 (二）TNF分子的功能 炎癥疾病中，TNF-a主要來(lái)源于單核巨噬細(xì)胞，同時(shí)淋巴細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞、中 性粒細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、肥大細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、表皮細(xì)胞和成骨細(xì)胞等也能產(chǎn)生 和釋放TNF- α 。 TNF-a與2種不同的受體TNFRl (p60、p55和CD120a，表達(dá)于所有有核細(xì)胞表面） 和TNFR2 (p80、p75和⑶120b，表達(dá)于造血干細(xì)胞系的細(xì)胞表面）結(jié)合，通過(guò)多種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo) 途徑（見(jiàn)圖6)在不同類(lèi)型細(xì)胞中、甚至同一類(lèi)型細(xì)胞不同分化階段中發(fā)揮多種不同的生物 學(xué)效應(yīng)。 TNF-α是維持機(jī)體免疫平衡的重要生物介質(zhì)，它參與淋巴細(xì)胞的遷移、活化、增殖 與分化以及淋巴組織的再生，在抗腫瘤、免疫防御和炎癥反應(yīng)中發(fā)揮重要作用。但值得 注意的是，TNF-α具有雙重生物學(xué)效應(yīng) ，一方面TNF和受體系統(tǒng)能夠誘導(dǎo)細(xì)胞程序化死 亡（即細(xì)胞凋亡），另一方面它又能促進(jìn)細(xì)胞增殖、分化和成熟使細(xì)胞得以存活并產(chǎn)生相應(yīng) 的多種生物學(xué)效應(yīng)。正常情況下，TNF和受體系統(tǒng)維持著這兩方面功能的平衡，當(dāng)這種平衡 在某些病理?xiàng)l件下被打破時(shí)，便可導(dǎo)致機(jī)體免疫環(huán)境和功能紊亂，發(fā)生疾病。 Shenm等研究表明，抗TNF-α抗體（例如Humira)能夠同時(shí)結(jié)合游離TNF-α和 細(xì)胞膜表面的TNF-α，從而阻止了 TNF-α與受體系統(tǒng)的結(jié)合，平衡TNF-α和受體系統(tǒng)的關(guān) 系，起到治療疾病的目的。圖7示出了此類(lèi)抗體藥與細(xì)胞膜表面TNF-α結(jié)合后產(chǎn)生的一系 列生物學(xué)反應(yīng)。 (三）治療性抗TNF抗體藥 TNF是機(jī)體免疫系統(tǒng)的一個(gè)關(guān)鍵性的細(xì)胞因子，多種自身免疫性疾病中發(fā)現(xiàn)TNF 過(guò)表達(dá)。目前，使用抗TNF抗體藥可以治療類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、銀屑病關(guān)節(jié)炎、強(qiáng)制性關(guān)節(jié) 炎、銀屑病、克羅恩病和炎性腸炎等。有5種TNF-α拮抗劑可用于臨床，包括Etanerc印t、 Infliximab、Adalimumab、Golimumab 和 Certolizumab pegoL· 因?yàn)槟[瘤壞死因子在免疫調(diào)節(jié)上起關(guān)鍵作用，TNF抗體藥的可能臨床適應(yīng)癥多 達(dá)20余種。目前歐美尚有幾十個(gè)臨床實(shí)驗(yàn)擴(kuò)展TNF抗體藥的適應(yīng)癥。這些適應(yīng)癥包括： 尋常性銀屑病（Psoriasis Vulgaris)、急性移植物抗宿主病（Acute Graft Versus Host Disease)、白血病、皮膚粘膜淋巴結(jié)綜合征（Mucocutaneous Lymph Node Syndrome)、川崎 病（Kawasaki Disease)、盤(pán)狀紅斑狼瘡（DLE)、移植物抗宿主病、HIV感染、Moderate to Severe Active Axial脊椎關(guān)節(jié)炎、扁平苔蘚（Lichen Planus)、肺炎、特發(fā)性肺炎綜合征 (Idiopathic Pneumonia Syndrome)、肺癌、前列腺癌、腫瘤轉(zhuǎn)移、Bone Cancer Stomatitis、 包涵體肌炎（Inclusion Body Myositis)、風(fēng)濕性多肌痛（Polymyalgia Rheumatica)、 急性非感染性肺功能障礙（Acute Non-Infectious Pulmonary Dysfunction)、I 型糖尿 病、皮肌炎（Dermatomyositis)、代謝綜合征、肥胖癥、高血壓、高血脂、狼瘡性腎炎（Lupus Nephritis)、腰骶神經(jīng)根病（Lumbosacral Radiculopathy)、慢性梗阻性肺疾病惡化（C0PD Exacerbation)、支氣管炎、克羅恩氏病、結(jié)腸炎。 1) ·抗 TNF α 抗體：Humira I"3 年英國(guó) Cambridge Antibody Technology 與美國(guó) BASF Bioresearch Corporation的聯(lián)合研究中心通過(guò)噬菌體展示技術(shù)發(fā)現(xiàn)了全人源抗TNF單克隆抗體的潛在 臨床價(jià)值。1999年全人源抗TNF單克隆抗體藥（Humira)早期臨床試驗(yàn)取得了較好的初步 結(jié)果，為全面深入的開(kāi)展臨床試驗(yàn)奠定了基礎(chǔ)。2001年271例類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的臨床試驗(yàn)結(jié) 果證明，50%的病人聯(lián)合使用Humira和甲氨蝶呤取得了至少50%以上的病情改善。2002 年Abbott公司建設(shè)了一個(gè)先進(jìn)的生物制品車(chē)間生產(chǎn)Humira。2002年12月31號(hào)，美國(guó)FDA 正式批準(zhǔn)Humira用于治療類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎。2003年Humira上市銷(xiāo)售，用于治療類(lèi)風(fēng)濕性 關(guān)節(jié)炎，同時(shí)開(kāi)展其他適應(yīng)癥的臨床試驗(yàn)。2005年美國(guó)FDA批準(zhǔn)Humira用于治療銀屑病關(guān) 節(jié)炎，當(dāng)年首次取得了 10億美元的銷(xiāo)售額。2005年12月10日，在日本申請(qǐng)了類(lèi)風(fēng)濕性關(guān) 節(jié)炎的新藥證書(shū)。2006年申請(qǐng)了克羅恩本文檔來(lái)自技高網(wǎng)...

【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
一種全人源抗體，其特征在于：所述抗體的重鏈可變區(qū)的CDR1的氨基酸序列為GFTFSSYDMH，CDR2的氨基酸序列為VIWSDGSIKYYADSVKG，CDR3的氨基酸序列為EVESAMGGFYYNGMDV；并且所述抗體的輕鏈可變區(qū)的互補(bǔ)決定區(qū)選自以下1)、2)和/或3)：1)CDR1為RASQDIGFDLG，CDR2為AASSLQS，且CDR3為L(zhǎng)QHKSYPLT；2)CDR1為RASQSIGFDLG，CDR2為AASSSQS，且CDR3為L(zhǎng)QHRSYPLT；3)CDR1為RASQDIGFDLG，CDR2為AASTLPR，且CDR3為L(zhǎng)QHKSYPLT。

【技術(shù)特征摘要】

【專(zhuān)利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：馮曉，張潔涵，李福軍，王濤，李新靈，
申請(qǐng)(專(zhuān)利權(quán))人：北京安保康生物醫(yī)藥科技有限公司，
類(lèi)型：發(fā)明
國(guó)別省市：北京;11