本發(fā)明專(zhuān)利技術(shù)公開(kāi)了一種溶血性貧血患者外周血單核細(xì)胞的分離方法，其包括：1)取外周血加入離心管中，離心去除富血小板血漿液層；2)加入濃度為3％的明膠生理鹽水溶液，對(duì)沉淀細(xì)胞進(jìn)行重懸；自然沉淀，收集明膠懸液層，并離心棄上液；3)往離心管中加入無(wú)血清培養(yǎng)基再次重懸細(xì)胞；4)將重懸細(xì)胞懸液加在淋巴細(xì)胞分離液的液面上，離心并將白霧狀細(xì)胞層轉(zhuǎn)移；5)對(duì)白霧狀細(xì)胞層進(jìn)行離心，除上清，再加入PBS溶液洗滌三次，加入無(wú)血清AIM-V培養(yǎng)基配置成懸液。本發(fā)明專(zhuān)利技術(shù)先采用低的離心力對(duì)外周血進(jìn)行離心，保證去除的上層清液中含有盡可能多的血小板。同時(shí)，又通過(guò)加入明膠生理鹽水溶液，對(duì)破碎的紅細(xì)胞加速沉淀，大大降低紅細(xì)胞殘留。
【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】
本專(zhuān)利技術(shù)涉及生物，尤其涉及一種溶血性貧血患者外周血單核 細(xì)胞的分離方法。
技術(shù)介紹
溶血性貧血（hemolyticanemia，HA)，指紅細(xì)胞破壞加速，而骨髓造血 功能代償不足時(shí)發(fā)生的一類(lèi)貧血。溶血（hemolysis)是紅細(xì)胞遭到破壞，壽命縮短的過(guò)程。 骨髓具有正常造血6~8倍的代償能力，當(dāng)溶血超過(guò)骨髓的代償能力，引起的貧血即為溶血 性貧血；當(dāng)溶血發(fā)生而骨髓能夠代償時(shí)，可無(wú)貧血，稱(chēng)為溶血狀態(tài)（hemolyticstate)。溶血 性貧血的根本原因是紅細(xì)胞壽命縮短，而造成紅細(xì)胞破壞加速的原因可概括為兩個(gè)方面： 紅細(xì)胞本身的內(nèi)在缺陷和紅細(xì)胞外部因素異常。前者多為遺傳性溶血，后者引起獲得性溶 血。其中，紅細(xì)胞內(nèi)在缺陷主要包括紅細(xì)胞膜缺陷、紅細(xì)胞酶缺陷、珠蛋白異常等。紅細(xì)胞 外部因素異常主要包括免疫性因素、非免疫性因素。溶血性貧血的臨床表現(xiàn)主要與溶血過(guò) 程持續(xù)的時(shí)間和溶血的嚴(yán)重程度有關(guān)。目前單核細(xì)胞分離技術(shù)，多采用Ficoll_Hypaque(d= 1. 077)分層法：S卩聚鹿糖 (Ficoll)-泛影葡胺（Urografin)分層法；主要用于分離外周血中的單個(gè)核細(xì)胞，是一種單 次密度梯度離心分離法。聚蔗糖一泛影葡胺是一種較理想的細(xì)胞分層液，其主要成分是一 種合成的蔗糖聚合物稱(chēng)聚蔗糖（商品名為Ficoll)，分子量為40kD，具有高密度、低滲透壓、 無(wú)毒性的特點(diǎn)。高濃度的Ficoll溶液粘性高，易使細(xì)胞聚集，故通常使用60g/L的低濃度溶 液，密度為1. 020,添加比重為1. 200的泛影葡胺（urografin)以增加密度。國(guó)外常用商品 Isopaque或Hypaque，故又稱(chēng)Ficoll-Hypaque分層液，將適量340g/L泛影葡胺加入Ficoll 溶液中即可配制成密度合適的分層液。分離人外周淋巴細(xì)胞以密度為1.077±0. 001的 分層液最佳，因?yàn)槿说募t細(xì)胞密度為1. 093,粒細(xì)胞密度為1. 092,單個(gè)核細(xì)胞在1. 076~ 1. 090之間。分離時(shí)先將分層液置試管底層，然后將肝素化全血以Hanks液或磷酸鹽緩沖液 PBS液作適當(dāng)稀釋后，輕輕疊加在分層液上面，使兩者形成一個(gè)清晰的界面。水平式離心后， 離心管中會(huì)出現(xiàn)幾個(gè)不同層次的液體和細(xì)胞帶。紅細(xì)胞和粒細(xì)胞密度大于分層液，同時(shí)因 紅細(xì)胞遇到Ficoll而凝集成串錢(qián)狀而沉積于管底。血小板則因密度小而懸浮于血漿中，唯 有與分層液密度相當(dāng)?shù)膯蝹€(gè)核細(xì)胞密集在血漿層和分層液的界面中，呈白膜狀，吸取該層 細(xì)胞遞經(jīng)洗滌高心重懸。本法分離單個(gè)核細(xì)胞純度可達(dá)95%，淋巴細(xì)胞約占90%~95%。 但是現(xiàn)有的淋巴細(xì)胞分離技術(shù)主要針對(duì)正常人的靜脈血，分離效果較好。但是對(duì) 溶血性貧血患者，分離效果較差，常混有大量破碎紅細(xì)胞和血小板，導(dǎo)致后期淋巴細(xì)胞質(zhì)量 不高，后期擴(kuò)大培養(yǎng)很難。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
為了克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，本專(zhuān)利技術(shù)的目的是提供一種分離效果好，破碎 的紅細(xì)胞和血小板基本不殘留的溶血性貧血患者外周血單核細(xì)胞的分離方法。 本專(zhuān)利技術(shù)的技術(shù)方案為：，所述分 離方法包括以下步驟： 1)取溶血性貧血患者外周血加入離心管中，低速離心，共分為三層，將頂層的富血 小板血漿液面層除去； 2)往離心管中加入濃度為3%明膠生理鹽水溶液，對(duì)沉淀細(xì)胞進(jìn)行重懸； 3)將重懸的細(xì)胞溶液自然沉淀60-70min，收集離心管中的明膠懸液層，并離心棄 去上層清液； 4)往離心管中加入無(wú)血清培養(yǎng)基再次重懸細(xì)胞； 5)將重懸的細(xì)胞懸液加在淋巴細(xì)胞分離液的液面上，離心并將離心管中層白霧狀 細(xì)胞層轉(zhuǎn)移到新的離心管中； 6)對(duì)白霧狀細(xì)胞層進(jìn)行離心，除上清，再加入PBS溶液，重懸洗滌，重復(fù)兩次，加入 無(wú)血清A頂-V培養(yǎng)基配置成懸液備用。 本專(zhuān)利技術(shù)中，先對(duì)溶血性貧血患者外周血進(jìn)行低速離心，去除上層的血小板，然后往 底部沉淀的紅細(xì)胞和淋巴細(xì)胞液中加入3%明膠生理鹽水溶液自然沉淀，從而進(jìn)一步去除 紅細(xì)胞。將經(jīng)前面步驟預(yù)處理過(guò)的細(xì)胞懸液，再通過(guò)步驟4和步驟5的再次分離，除去明膠、 淋巴細(xì)胞分離液等溶液，從而達(dá)到提高分離效果，避免血小板和紅細(xì)胞殘留的目的。 進(jìn)一步，所述步驟1)具體為：取溶血性貧血患者外周血加入離心管中，20°C， 200Xg離心10-20min，溶液共分為三層，將頂層的富血小板血漿液面層除去。本專(zhuān)利技術(shù)中，通 過(guò)較低離心力200Xg進(jìn)行離心，使得紅細(xì)胞和淋巴細(xì)胞沉淀的同時(shí)，保證上層清液中含有 盡可能多的血小板，達(dá)到高效去除血小板的目的。 所述步驟2)中，加入的明膠生理鹽水溶液和中間液面層的總體積與離心管底部 沉淀層的體積比例為2-2. 5:1。通過(guò)加入明膠生理鹽水溶液，可破壞紅細(xì)胞表面電荷而加速 紅細(xì)胞的沉淀，對(duì)破碎的紅細(xì)胞具有同樣的加速沉淀效果，同時(shí)對(duì)淋巴細(xì)胞無(wú)影響。所以， 本專(zhuān)利技術(shù)中加入3%明膠生理鹽水溶液可大大降低紅細(xì)胞殘留。 進(jìn)一步，所述步驟3)中，先在20°C下，將重懸的細(xì)胞溶液自然沉淀60-70min，收集 離心管中的明膠懸液層，然后將明膠懸液層在200Xg的離心力下離心lOmin，棄去上層清 液。 進(jìn)一步，所述步驟5)具體為：另一離心管中預(yù)先裝入淋巴分離液，再將重懸的細(xì) 胞懸液加在淋巴細(xì)胞分離液的液面上，重懸的細(xì)胞懸液和淋巴細(xì)胞分離液體積比為1-2 : 1，然后400Xg離心30~40min，用吸管吸取離心管中的中層白霧狀細(xì)胞層轉(zhuǎn)移到新的離心 管中。由于淋巴細(xì)胞分離液Ficoll密度為1. 077±0. 001，單核細(xì)胞密度為1. 076~1. 090， 兩者密度最為接近，單核細(xì)胞密集在血漿層和淋巴細(xì)胞分離液層的界面中，呈白霧狀。 所述步驟6)具體為：所述白霧狀細(xì)胞層450Xg離心lOmin后去除上層清液，再加 入PBS溶液，重懸洗滌，重復(fù)兩次，加入無(wú)血清A頂-V培養(yǎng)基配置成懸液。 本專(zhuān)利技術(shù)的有益效果為：本專(zhuān)利技術(shù)先采用低的離心力對(duì)外周血進(jìn)行離心，使得紅細(xì)胞 和淋巴細(xì)胞沉淀的同時(shí)，保證上層清液中含有盡可能多的血小板，達(dá)到高效去除血小板的 目的。同時(shí)，又通過(guò)加入明膠生理鹽水溶液，可破壞紅細(xì)胞表面電荷而加速紅細(xì)胞的沉淀， 對(duì)破碎的紅細(xì)胞具有同樣的加速沉淀效果，同時(shí)對(duì)淋巴細(xì)胞無(wú)影響，從而大大降低紅細(xì)胞 殘留。最后，通過(guò)無(wú)血清培養(yǎng)基和淋巴細(xì)胞分離液再進(jìn)行一次分離，保證分離的單核細(xì)胞基 本無(wú)紅細(xì)胞和血小板殘留，便于后期單核細(xì)胞的擴(kuò)大培養(yǎng)。【具體實(shí)施方式】 下面結(jié)合對(duì)本專(zhuān)利技術(shù)作進(jìn)一步詳細(xì)的說(shuō)明。 為使本專(zhuān)利技術(shù)的目的、技術(shù)方案和優(yōu)點(diǎn)更加清楚明了，下面結(jié)合【具體實(shí)施方式】，對(duì)本 專(zhuān)利技術(shù)進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明。應(yīng)該理解，這些描述只是示例性的，而并非要限制本專(zhuān)利技術(shù)的范圍。此 外，在以下說(shuō)明中，省略了對(duì)公知技術(shù)的描述，以避免不必要地混淆本專(zhuān)利技術(shù)的概念。 本專(zhuān)利技術(shù)提供，所述分離方法包括 以下步驟： 1)取溶血性貧血患者外周血加入離心管中，低速離心，共分為三層，將頂層的富血 小板血漿液面層除去； 2)往離心管中加入濃度為3%明膠生理鹽水溶液，對(duì)沉淀細(xì)胞進(jìn)行重懸； 3)將重懸的細(xì)胞溶液自然沉淀60-70min，收集離心管中的明膠懸液層，并離心 棄去上層清液； 4)往離心管中加入無(wú)血清培養(yǎng)基再次重懸細(xì)胞； 5)將重懸的細(xì)胞懸液加在淋巴細(xì)胞分離液的液面上，離心并將離心管中層白霧狀 細(xì)胞層轉(zhuǎn)移到新的離心管中； 6)對(duì)本文檔來(lái)自技高網(wǎng)...
【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
一種溶血性貧血患者外周血單核細(xì)胞的分離方法，其特征在于：所述分離方法包括以下步驟：1)取溶血性貧血患者外周血加入離心管中，低速離心，溶液分為三層，將頂層的富血小板血漿液面層除去；2)往離心管中加入濃度為3％的明膠生理鹽水溶液，對(duì)沉淀細(xì)胞進(jìn)行重懸；3)將重懸的細(xì)胞溶液自然沉淀60?70min，收集離心管中的明膠懸液層，并離心棄去上層清液；4)往離心管中加入無(wú)血清培養(yǎng)基再次重懸細(xì)胞；5)將重懸的細(xì)胞懸液加在淋巴細(xì)胞分離液的液面上，離心并將離心管中層白霧狀細(xì)胞層轉(zhuǎn)移到新的離心管中；6)對(duì)白霧狀細(xì)胞層進(jìn)行離心，除上清，再加入PBS溶液，重懸洗滌，重復(fù)兩次，加入無(wú)血清AIM?V培養(yǎng)基配置成懸液。
【技術(shù)特征摘要】
【專(zhuān)利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：卓凡清，馬健穎，
申請(qǐng)(專(zhuān)利權(quán))人：上海麥禾生物科技有限公司，
類(lèi)型：發(fā)明
國(guó)別省市：上海;31
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