使用仙臺病毒作為載體的抗結核桿菌疫苗制造技術

本發明專利技術提供表達結核分枝桿菌免疫優勢抗原的重組仙臺病毒載體疫苗，可作為治療性和預防性抗結核疫苗使用。通過鼻內免疫該疫苗，成功而有效地誘導針對結核菌的保護性免疫應答，且未觀察到免疫接種引起的病理癥狀。將其作為預防性抗結核疫苗，鼻內接種在小鼠模型中成功誘導明顯的抗原特異性細胞免疫應答。結核菌的攻擊保護實驗發現，與對照動物相比被免疫小鼠的肺臟和脾臟中的結核桿菌明顯減少，其機制與在肺部誘導產生的強烈抗原特異性T細胞免疫應答尤其是CD8+T細胞免疫反應相關。作為治療性疫苗，獲得與利福平(RFP)相當的療效，二者聯用后能明顯提高抗結核效果。因此本發明專利技術的重組仙臺病毒載體疫苗是非常有前景的抗結核候選疫苗之一。

【技術實現步驟摘要】
專利
本專利技術涉及利用仙臺病毒作為載體的抗結核桿菌疫苗。本專利技術也涉及使用仙臺病毒載體接種的方法，以及其在結核分枝桿菌感染的預防或治療中的用途。專利技術背景結核病是影響人類健康的主要殺手之一。作為結核病(TB)的病原體，結核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis)是全世界細菌感染疾病中最主要的死亡原因——潛伏性感染影響世界人口的三分之一。根據世界衛生組織最新的報告，2012年全球共有新發病例860萬，死亡病例130萬。作為人類歷史上對抗傳染病最有效的方式之一，疫苗在諸多疾病的預防控制中發揮了重要作用。卡介苗(Bacillus Calmette–Guérin,BCG)源自牛分枝桿菌(Mycobacterium bovis)的減弱菌株，其迄今為止仍是針對TB的唯一經過批準的疫苗。然而，發現BCG對于成人的效果差異較大，特別是在不同種族中。BCG的有效性隨著年齡的增長而下降，因此對于預防成人的疾病效果并不好，特別是在TB高發地區。BCG疫苗接種已經用于預防結核腦膜炎并幫助防止肺結核分枝桿菌向肺外部位擴散，但是不能預防感染。BCG疫苗的另一局限是胃腸外投遞不能在肺粘膜中誘導有力的T細胞免疫，而這一點恰是針對肺結核分枝桿菌進行保護關鍵性的。已提出幾種假說來解釋BCG對肺結核病的不佳的保護效果，其中一種認為BCG未能誘導充分的CD8+T細胞應答(參見)。最近的研究顯示，除了Th1型CD4+T細胞免疫以外，誘導CD8+T細胞應答對于針對結核分枝桿菌感染的免疫是至關重要的。BCG效果的局限性和TB的全球流行性促使各國研究人員致力于產生新的更有效的抗結核疫苗。基于活病毒載體的疫苗具有誘導有效而持久的抗原表達的能力，是研究最廣泛的疫苗載體之一(Cairns,J.S.和Sarver,N.,1998年，《人逆病毒的AIDS
研究》)(AIDS Res.Hum.Retroviruses)14卷:第1501-1508頁；Hirsch,V.M.等人，1996年，《病毒學雜志》70卷：第3741-3752頁；Buge,S.L.等人，1997年，《病毒學雜志》71卷：第8531-8541頁)。其中，痘病毒和腺病毒載體是研究最廣泛的載體，均已完成臨床試驗。但是，Ⅱa期臨床試驗發現，抗結核痘病毒載體疫苗并不能夠誘導足夠的保護性抗結核免疫應答。研究認為，病毒載體引發有效的保護性免疫應答取決于許多因素，如抗原表達的水平和持久性、載體病毒復制的動力學，以及載體病毒的趨性和致病性等。目前可用的病毒載體都有各自的優缺點。因此，選擇最佳的基于病毒載體的免疫方案需要精確的評估和比較。基于病毒載體的疫苗免疫方案的一個致命缺點是它會誘導靶抗原以外的針對載體病毒本身的強烈免疫應答。這一問題可以利用兩個或兩個以上不同種類的載體疫苗分別進行“初次免疫(priming)”和“加強免疫(boosting)”的方法來解決。其中，DNA載體初次免疫(下文簡稱為初免)-病毒載體加強是研究最廣泛的免疫形式之一(Hanke,T.等人1999年，《病毒學雜志》，73卷：第7524-7532頁；Robinson,H.L.等人，1999年，《自然學方法》(Nat.Med)，第5卷:第526-534頁)。所以，仍然有必要開發病毒載體的新種類。由于結核分枝桿菌感染不斷增加的危險和全球流行性，本領域中迫切需要開發有效而安全的結核疫苗。
技術實現思路
本專利技術提供一種含有編碼結核桿菌蛋白質的仙臺病毒載體及從該載體制備的疫苗。具體地，本專利技術提供一種融合表達結核分枝桿菌蛋白Ag85的仙臺病毒載體及其疫苗。在一個優選的實施方案中，編碼的結核桿菌蛋白質為Ag85，其包含選自如下的蛋白質或片段的氨基酸序列：Ag85A、Ag85B、其片段或上述任一項的組合。在一個實施方案中，所述結核桿菌蛋白包含Ag85A與Ag85B蛋白或其片段的氨基酸序列的嵌合體。在一個進一步的實施方案中，所述結核桿菌蛋白包含Ag85A蛋白的氨基酸序列(SEQ ID No:2)與Ag85B的第125-282位氨基酸(SEQ ID No:5)的氨基酸序列的嵌合體(SEQ ID No:8)，所述編碼Ag85B蛋白第125-282位氨基酸序列片段的基因嵌合在Ag85A基因的序列中，嵌合位點為Ag85A基因的第245-250位限制性內切酶Kpn I識別序列和/或第430-435
位內切酶Acc I識別序列。在一個實施方案中，本專利技術涉及將一種結核桿菌嵌合基因通過本領域公知的質粒構建方法插入到仙臺病毒載體中，如上文所述的，該嵌合基因優選包含Ag85A蛋白的編碼序列(SEQ ID No:1)與編碼Ag85B的第125-282位氨基酸(SEQ ID No:5)的核苷酸序列的嵌合體(SEQ ID No:6或7)，嵌合位點優選為Ag85A基因的第245-250位限制性內切酶Kpn I識別序列和/或第430-435位內切酶Acc I識別序列。本專利技術還涉及由該嵌合基因所編碼的嵌合結核桿菌Ag85蛋白。在一個實施方案中，要插入編碼結核桿菌蛋白質的基因的所述仙臺病毒載體(SeV)有F基因缺陷。具體地，所述仙臺病毒載體缺失F基因。在一個實施方案中，構建得到的重組仙臺病毒載體在LLC-MK2細胞中成功表達Ag85蛋白。本專利技術進一步涉及如上述的任一種重組仙臺病毒載體在制備預防和/或治療結核桿菌感染或結核病的疫苗中的用途。另外，本專利技術還涉及一種預防和/或治療結核桿菌感染或結核病的方法，包括對受試者施用如上文所述的重組仙臺病毒載體的疫苗。優選地，所述結核病為肺結核病。在一個實施方案中，本專利技術提供如上述的任一種仙臺病毒載體的疫苗可作為抗結核預防性疫苗使用。在另一個實施方案中，本專利技術提供上述任一種仙臺病毒載體疫苗可作為抗結核治療性疫苗使用。在一個方面，本專利技術的仙臺病毒載體的疫苗可以經鼻腔內給藥或肌肉內注射的方式一次或多次地施用給受試者。在一個實施方案中，本專利技術的仙臺病毒載體疫苗以多價疫苗接種的形式接種至少一次。具體地，所述仙臺病毒載體疫苗與BCG疫苗聯合施用，BCG疫苗的施用可在所述仙臺病毒載體疫苗的施用之前、同時或之后。優選地，受試者先前已接受過BCG疫苗的初次免疫，然后使用本專利技術的仙臺病毒載體疫苗進行加強免疫。本專利技術還提供一種包含上文所述的重組仙臺病毒載體疫苗任選和至少一種另外的免疫學作用劑用于在受試者中預防結核桿菌感染的用途，其中所述另外的免疫學作用劑可以是BCG疫苗或表達結核桿菌免疫優勢抗原的任何其他免疫制劑，如核酸疫苗或重組亞單位疫苗等。優選地，本專利技術提供上述仙臺病毒載體疫苗與BCG疫苗組合用于預防結核病。在一個實施方案中，本專利技術提供編碼上述結核桿菌蛋白的仙臺病毒載體
在制備治療結核病的疫苗中的用途。本專利技術還提供一種包含上文所述的重組仙臺病毒載體疫苗用于治療患有結核病的受試者的用途，任選地所述重組仙臺病毒載體疫苗與至少一種另外的結核桿菌治療劑一起施用，其中所述另外的結核桿菌治療劑可以是利福平(RFP)或抑制結核桿菌的任何其他藥劑。優選地，本專利技術提供上述仙臺病毒載體疫苗與利福平組合用于治療結核病。所述受試者可以是有感染結核桿菌風險或已患有結核病的動物，比如小鼠，或者是人。在一個實施方案中，本專利技術還提供一種本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種仙臺病毒載體的疫苗，其中所述載體表達結核分枝桿菌免疫抗原，優選表達結核分枝桿菌分泌蛋白Ag85。

【技術特征摘要】
1.一種仙臺病毒載體的疫苗，其中所述載體表達結核分枝桿菌免疫抗原，優選表達結核分枝桿菌分泌蛋白Ag85。2.權利要求1的疫苗，其中所表達的結核分枝桿菌抗原包含Ag85A蛋白、和/或Ag85B蛋白、和/或其片段以及上述它們的嵌合體的氨基酸序列。3.權利要求1或2的疫苗，所使用的載體為F基因缺陷的仙臺病毒載體。4.權利要求1-3中任一項的仙臺病毒載體疫苗作為抗結核預防性疫苗使用的用途。5.權利要求4的用途，其中所述疫苗通過鼻內接種的方式免疫。6.權利要求4或5的用途，其中所述疫苗以多價疫苗的形式接種至少一次。7.權利要求1-3中任一項的仙臺病毒載體疫苗作為抗結核治療性疫苗使用的用途...

【專利技術屬性】
技術研發人員：范小勇，朱亞峰，胡志東，羅道良，
申請(專利權)人：上海市公共衛生臨床中心，株式會社愛迪藥業，
類型：發明
國別省市：上海;31