本發(fā)明專利技術(shù)涉及一種新型枯草芽孢桿菌多價載體疫苗及其應(yīng)用。所述疫苗包括利用基因工程方法得到的枯草芽孢桿菌重組菌株，該菌株分類命名是枯草芽孢桿菌HT5302，已保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏號為CCTCCNo：M2012380。該枯草芽孢桿菌多價載體疫苗是以枯草芽孢桿菌重組菌株作為核心制備而成，通過誘導(dǎo)枯草芽孢桿菌重組菌株可產(chǎn)生表面展示無乳鏈球菌3-磷酸甘油醛脫氫酶（GAPDH）蛋白的芽孢，芽孢萌發(fā)形成營養(yǎng)細胞時可以分泌穿膜肽與鰻弧菌3-磷酸甘油醛脫氫酶（GAPDH）形成的融合蛋白。該疫苗具有對鏈球菌病、弧菌病、愛德華氏菌病和嗜水氣單胞菌等細菌性病害的多效價防護作用。
【技術(shù)實現(xiàn)步驟摘要】
本專利技術(shù)屬于微生物學(xué)、免疫學(xué)和水產(chǎn)動物病害防治領(lǐng)域，特別是涉及到一種用于防治魚類因弧菌、愛德華氏菌、鏈球菌和嗜水氣單胞菌引發(fā)病害的新型枯草芽孢桿菌多價載體疫苗及其應(yīng)用。
技術(shù)介紹
水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)已經(jīng)成為世界上發(fā)展最快的動物源性食品生產(chǎn)業(yè)之一。據(jù)世界糧農(nóng)組織(FAO) 2010年統(tǒng)計資料顯示自2000年以來，漁品的增長主要來自于水產(chǎn)養(yǎng)殖。隨著水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)規(guī)模化、集約化和工業(yè)化的發(fā)展，展示在我們面前的將是一個以魚類養(yǎng)殖為發(fā)展重點的水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)。然而，隨著水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的快速發(fā)展，接踵而至的是各種病害的爆發(fā)。世界各國的生產(chǎn)實踐表明，病害爆發(fā)和蔓延已經(jīng)成為世界范圍內(nèi)水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)獲取更大發(fā)展的一個重要制約因素，各種重大傳染性疫病的風(fēng)險始終是水產(chǎn)養(yǎng)殖漁業(yè)中最為重大的風(fēng)險之一。我國的水產(chǎn)養(yǎng)殖平均死亡損失率在30%以上，每年的經(jīng)濟損失高達數(shù)百億元。病害問題業(yè)已成為水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)健康和可持續(xù)發(fā)展的關(guān)鍵性制約因素之一。針對各種病害的發(fā)生，一個全球性關(guān)注的挑戰(zhàn)已經(jīng)凸現(xiàn)隨著抗生素抗藥病原的大量出現(xiàn)和蔓延而導(dǎo)致大量藥物防治效力的逐漸喪失、化學(xué)藥物等導(dǎo)致的環(huán)境污染以及水產(chǎn)品的藥物殘留等負面影響日趨嚴重，我們已步入一個后抗生素時代，水產(chǎn)品安全已成為備受關(guān)注的全球性問題。 預(yù)防性治療可以防止或大幅減少易感病害的發(fā)生發(fā)展，利用生物技術(shù)開發(fā)的各種疫苗使水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)有更多機會面對挑戰(zhàn)，為水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)生產(chǎn)的健康發(fā)展起到關(guān)鍵性支撐作用。為遏制各種環(huán)境因素和養(yǎng)殖密度激增等造成的水產(chǎn)養(yǎng)殖病害日益嚴重的趨勢，推進水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的健康可持續(xù)發(fā)展，接種疫苗已成為世界范圍內(nèi)現(xiàn)代水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)發(fā)達國家和地區(qū)的生產(chǎn)養(yǎng)殖規(guī)范。我國水產(chǎn)養(yǎng)殖的重要經(jīng)濟魚類品種繁多，主要為以羅非魚、草魚、鯰魚為代表的大宗淡水魚類和以鲆鰈魚類、鱸魚、大黃魚和石斑魚為代表的海水魚類。在過去的十多年中，世界范圍內(nèi)主要爆發(fā)的是弧菌病(Vibriosis,鰻弧菌Vibrio anguillarum、溶藻弧菌Vibrio alginolyticus、哈氏弧菌Vibrio harveyi等為重要病原)、愛德華氏菌病(Edwardsiel Iosis,其中遲純愛德華氏菌Edwardsiella tarda和魚愛德華氏菌Edwardsiella ictaluri為重要病原)、鏈球菌病(Streptococcicosis,海豚鏈球菌Streptococcus iniae和無乳鏈球菌Streptococcus agalactiae為重要病原)和氣單胞菌病(Haemorrhagic septicaemia and ulcer,嗜水氣單胞菌 Aeromonas hydrophila 為重要病原)等重大細菌性病害，嚴重制約了我國的魚類養(yǎng)殖生產(chǎn)的健康可持續(xù)發(fā)展，使我國魚類養(yǎng)殖生產(chǎn)蒙受巨大損失。針對上述重要魚類病害，目前主要采取以各種抗生素為代表的化學(xué)療法。我國除草魚出血病病毒疫苗外，尚未有任何商品化細菌性魚類疫苗問世。在生產(chǎn)養(yǎng)殖環(huán)境中，由于各種病害病原可在養(yǎng)殖水體中同時傳播，養(yǎng)殖魚類面對的將是一個多病原共同侵襲的挑戰(zhàn)，因此只針對單一病原病害的單效價疫苗在生產(chǎn)中很難達到較好的實際防治應(yīng)用效果。開發(fā)可同時預(yù)防多種重要病原的多價疫苗始終是水產(chǎn)疫苗的重要方向，有著巨大而現(xiàn)實的市場迫切需求。目前國內(nèi)外針對弧菌(Vibrio spp.)、鏈球菌(Streptococcus spp.)、愛德華氏菌(Edwardsiella spp.)和氣單胞菌(Aeromonasspp.)的單效價疫苗或多聯(lián)疫苗已有不少文獻報道，但可同時針對上述四種重要細菌性病原而設(shè)計研發(fā)的多價疫苗還未有文獻報道。在水產(chǎn)疫苗的開發(fā)中，疫苗接種給藥方式往往是制約其商業(yè)化應(yīng)用的關(guān)鍵制約因素。魚類疫苗在生產(chǎn)應(yīng)用中主要有三種接種給藥方式注射、浸泡和口服。注射接種是目前已開發(fā)的水產(chǎn)疫苗中所有接種方式中免疫效果最好，保護期也最長，但由于其接種操作需要大量人力和特殊設(shè)備設(shè)施，耗時較長，因此給藥成本最高，水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)往往難以承受其給藥成本。同時,注射接種往往給魚造成較高的應(yīng)激刺激,所以副作用和操作損失往往也較高。并且，這種接種方式很難應(yīng)用到魚苗期和幼魚期(一般大于20g以上)，在實際生產(chǎn)養(yǎng)殖 中其應(yīng)用范圍受到很大限制。浸泡接種是將魚放入一定濃度的疫苗稀釋液中一段時間進行疫苗接種的方式，浸泡免疫的一個最大優(yōu)點是可為魚苗(體重I飛克)接種疫苗。其在生產(chǎn)應(yīng)用也較易為水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)接受。口服主要是通過將疫苗和飼料結(jié)合通過飼喂方式進行疫苗接種，這種接種方式在生產(chǎn)應(yīng)用中最方便也最溫和，不會給魚類造成應(yīng)激反應(yīng)。如果免疫效力得到保證，這是水產(chǎn)疫苗最為理想的疫苗產(chǎn)品應(yīng)用形式。但從國內(nèi)外的研制開發(fā)和實際應(yīng)用中發(fā)現(xiàn)，該類型的疫苗由于無法避免魚類動物腸道的消化破壞的影響，往往保護期很短、免疫效力低下，難以獲得理想的免疫效果。鑒于關(guān)鍵應(yīng)用技術(shù)尚未有突破，目前國內(nèi)外市場上尚未有具有良好免疫效果的口服水產(chǎn)疫苗產(chǎn)品問世。綜上所述，針對養(yǎng)殖魚類主要重大病害，開發(fā)具有多種病害防治效力的經(jīng)濟、高效、使用便利的多效價口服疫苗是水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的迫切需求。針對多價口服疫苗的產(chǎn)品特性要求，其需解決的關(guān)鍵技術(shù)在于如下兩點1)篩選一種或多種針對魚類主要病害病原的保護性廣譜抗原；2)篩選并選取一種能夠穩(wěn)定定植存活于魚類動物腸道的載體菌株，其可耐受腸道的低PH環(huán)境和各種消化蛋白酶的破壞，能夠?qū)⒈Ｗo性廣譜抗原有效呈遞到魚類動物的相關(guān)免疫系統(tǒng)中以激發(fā)保護性免疫應(yīng)答反應(yīng)。同時，該載體菌株可耐受飼料制備工藝中各種加工環(huán)節(jié)的考驗，可方便地制備成飼料劑型產(chǎn)品，以實現(xiàn)口服接種的產(chǎn)品特性。3-磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)作為一個看家基因廣泛存在于幾乎所有的生物體中。GAPDH是一個傳統(tǒng)糖酵解蛋白，然而近年來的研究表明GAPDH在不同的亞細胞部位顯示出和糖酵解無關(guān)的多種活性功能(3化(^6，14.，1997，了 Cell Biochem,66 (2):133-40;Sirove,M. A. , 1999,Biochim Biophys Acta，1432(2):159_184)。在許多微生物(酵母，細菌和致病性寄生蟲)的細胞膜上發(fā)現(xiàn)有GAPDH存在，其中GAPDH做為外膜蛋白的潛在免疫保護性受到廣泛的關(guān)注。GAPDH的免疫原性首次發(fā)現(xiàn)于白色念珠菌(Gil-Navarro et al.，1997，J Bacteriol，179 :4992-4999)。目前在布魯氏菌和遲鈍愛德華氏菌中已經(jīng)證實，GAPDH能夠激發(fā)宿主的保護性免疫反應(yīng)(Kawai K. et al,2004, Vaceine, 22 :3411-3418 ；RosinnhaG. M. et al. ,2002, J Med Mierobiol,51 (8) :661_671)。同時許多致病菌的 GAPDH 的相似性非常高，X. Li等已證實GAPDH是重要的廣譜性保護抗原，在不同的病原菌間具有顯著的交叉免疫力(X. Li et al. , 2012, Letters in Applied Microbiology, 54 (I): 1-9)。因此，GAPDH具有開發(fā)成為一種針對多種水產(chǎn)養(yǎng)殖動物重要病原的候選廣譜抗原的潛力。枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)是一種好氧性的革蘭氏陽性細菌,對本文檔來自技高網(wǎng)...
【技術(shù)保護點】
一種新型枯草芽孢桿菌多價載體疫苗，其特征在于：所述疫苗包括利用基因工程方法得到的枯草芽孢桿菌重組菌株，該菌株的分類命名是枯草芽孢桿菌HT5302（Bacillus?subtilis?HT5302），已保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏號為CCTCCNo：M?2012380。
【技術(shù)特征摘要】
【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：不公告發(fā)明人，
申請(專利權(quán))人：無錫海健生物科技有限公司，
類型：發(fā)明
國別省市：
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