包含促紅細(xì)胞生成素和支化聚合物結(jié)構(gòu)的綴合物制造技術(shù)

本發(fā)明專利技術(shù)公開了包含促紅細(xì)胞生成素(EPO)和含有兩個(gè)單甲氧基聚乙二醇(mPEG)分枝的不對(duì)稱支化聚合物結(jié)構(gòu)的綴合物，其中所述mPEG分枝之一的分子量在10kDa和14kDa之間，和另一mPEG分枝的分子量在17kDa和23kDa之間；以及公開了包含該綴合物的藥物組合物。本發(fā)明專利技術(shù)還提供了用于獲得經(jīng)PEG化的EPO的方法，其特征在于，將所述蛋白質(zhì)綴合至具有兩個(gè)有著上述分子量的mPEG分枝的不對(duì)稱支化聚合物結(jié)構(gòu)。

【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】
【國(guó)外來華專利技術(shù)】
本專利技術(shù)涉及生物技術(shù)、生物科學(xué)和制藥工業(yè)領(lǐng)域，特別地涉及對(duì)分子進(jìn)行修飾以便改善其藥物代謝動(dòng)力學(xué)，其中增加其在血液中的半衰期和其生物學(xué)活性。現(xiàn)有技術(shù)近年來，生物分子用于在人類中的治療用途的使用有所增加，這主要是由于：(1)發(fā)現(xiàn)了新的蛋白質(zhì)和肽分子，(2)對(duì)于體內(nèi)作用機(jī)制有了更好的理解，(3)改善了蛋白質(zhì)的表達(dá)系統(tǒng)和肽的合成，和(4)改善了制劑或分子修飾技術(shù)，其使得能夠改善藥效動(dòng)力學(xué)和藥物代謝動(dòng)力學(xué)特性。在藥物的修飾釋放領(lǐng)域中的技術(shù)發(fā)展已經(jīng)使得能夠引入許多改變可注射藥物的釋放的系統(tǒng)，以便改善治療劑的藥效動(dòng)力學(xué)和藥物代謝動(dòng)力學(xué)特性。新的藥物釋放系統(tǒng)可以通過制劑的變化(例如，持續(xù)釋放產(chǎn)品或脂質(zhì)體)或者通過向藥物分子進(jìn)行添加(例如，PEG化，其僅為將藥物共價(jià)結(jié)合至一個(gè)或多個(gè)聚乙二醇(PEG)分子)來產(chǎn)生。新的釋放形式導(dǎo)致半衰期的增加、副作用的減少、藥物功效的提高以及患者的更好的生活質(zhì)量。持續(xù)釋放系統(tǒng)以受控的且預(yù)定的方式釋放藥物，并且尤其適合于其中避免在血漿中的濃度大幅波動(dòng)是重要的那些藥物。由于保護(hù)了對(duì)于降解敏感的蛋白質(zhì)以及經(jīng)延長(zhǎng)或經(jīng)修飾的釋放，已經(jīng)廣泛地研究了通過使用生物可降解的微球來進(jìn)行的分子的全身性釋放(Sinha，V.R.和Trehan，A.(2003).Biodegradable microspheres as protein delivery，J.Controlled Release，90(3)：261-280)。PEG化提供了一種用于修飾治療性蛋白質(zhì)以使生物分子的許多藥理學(xué)限制最小化的方法。例如，在血液中的半衰期由于數(shù)個(gè)原因而增加，其中包括：聚合物殘基可以阻止蛋白酶的攻擊以及該藥物被免疫系統(tǒng)識(shí)別，以及所述綴合物的相對(duì)于天然蛋白質(zhì)而言顯著更大的流體動(dòng)力學(xué)體積使得腎濾過明顯地減少。雖然在許多情況下蛋白質(zhì)的體外生物學(xué)活性受到PEG化影響，但是在血液中的壽命的重大增加使得其治療作用是更有效的(Harris J.M.和Chess R.B.(2003)Effect of pegylation on pharmaceuticals.Nat.Rev.Drug Discov.2：214-221)。PEG化的另一個(gè)益處為物理穩(wěn)定性的增加，這是由于其在空間上阻斷由疏水相互作用所誘導(dǎo)的降解途徑，并且產(chǎn)生減少在所述蛋白質(zhì)的熱不穩(wěn)定性中所牽涉的分子間相互作用的非特異性空間障礙。物理穩(wěn)定性的增加使得能夠獲得更穩(wěn)定的制劑(Harris J.M.和Chess R.B.(2003)Effect of pegylation on pharmaceuticals.Nat. Rev.Drug Discov.2：214-221)。由于第二代經(jīng)活化的PEG的出現(xiàn)，能夠擁有允許更有選擇性的PEG化的基團(tuán)(例如：優(yōu)先結(jié)合蛋白質(zhì)的N-末端的醛基團(tuán))和支化結(jié)構(gòu)(Roberts M.J.，Bentley M.D.，Harris J.M.(2002)Chemistry for peptide and protein PEGylation.Adv.Drug Deliv.Reviews.54：459-476)。所開發(fā)出的支化PEG包括具有兩個(gè)分枝的單官能PEG(專利號(hào)US 5,932,462)、具有四個(gè)分枝的四官能PEG和具有八個(gè)分枝的八官能PEG。關(guān)于治療性蛋白質(zhì)的綴合，更有用的經(jīng)活化的PEG為單官能PEG，因?yàn)槠浔苊庠摰鞍踪|(zhì)與該P(yáng)EG聚合物之間的交聯(lián)。支化PEG還具有傘型效應(yīng)，其允許更好的對(duì)于蛋白質(zhì)表面的保護(hù)。具有兩個(gè)分枝的單官能PEG使得能夠獲得與干擾素α-2a的綴合物，其顯示出在臨床上比天然蛋白質(zhì)更好的結(jié)果(Rajender Reddy K.，Modi M.W.，Pedder S.(2002).Use of peginterferon alfa-2a(40KD)(Pegasys)for the treatment of hepatitis C.Adv.Drug Deliv.Reviews.54：571-586)。存在有關(guān)于許多其中應(yīng)用了不同的修飾釋放技術(shù)的蛋白質(zhì)的報(bào)道，其中包括重組的人促紅細(xì)胞生成素(EPO)(rh EPO)。EPO為具有165個(gè)氨基酸的糖蛋白。取決于其糖基化程度，通過使用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(縮寫為SDS-PAGE)而估計(jì)的它的分子量在27kDa和39kDa之間變化(Mikaye，T.等人，(1977).Purification of Human erythropoietin.J.Biol.Chem.252：5558-5564)。在調(diào)查研究中已證明，通過撤除低氧刺激，在血液中EPO的信使核糖核酸(mRNA)快速減少，其中可能在3小時(shí)時(shí)無法檢測(cè)，這表明其半衰期是短的(Lacombe，C.等人，(1988)Peritubular cells are the site of erythropoietin synthesis in the murine hypoxic kidney.J.Clin.Invest.81：620-623；Koury，S.T.等人，(1989)Quantitation of erythropoietin producing cells in kidneys of mice by in situ hybridation：Correlation with hematocrit，renal erythropoietin mRNA and serum erythropoietin concentration.Blood 74：645-651)。據(jù)估計(jì)，EPO在血漿中的半衰期在4小時(shí)和13小時(shí)之間變化；當(dāng)與其他具有治療用途的分子相比較時(shí)，該時(shí)間是非常短的。這使得需要有規(guī)律地使用該激素的患者必須頻繁地注射以維持接近正常水平的紅細(xì)胞水平(Spivak，J.L.1992.The mechanism of action of erythropoietin：Erythroid cell response.J.W.Fisher(Ed.)Biochemical Pharmaeology of Blood and Blood-Forming Organs.Springer-Verlag Berlin.Handbook of Experimental Pharmacology.101：49-114；Jelkmann，W.(1986).Renal Erythropoietin：Properties and Production.Rev.Physiol.Biochem.Pharmacol.104：139-205)。為了增加rh EPO的半衰期，對(duì)該分子進(jìn)行了突變以增加N-糖基化位點(diǎn)(Burke，Paul(2003).Device for the sustained release of aggregation-stabilized，biologically active agent.美國(guó)專利申請(qǐng)?zhí)?0030133979)，它被包囊在微球(Morlock M.等人，(1998).Erythropoietin loaded microspheres prepared from biodegradable LPLG-P本文檔來自技高網(wǎng)...

【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
包含促紅細(xì)胞生成素(EPO)和含有兩個(gè)單甲氧基聚乙二醇(mPEG)分枝的不對(duì)稱支化聚合物結(jié)構(gòu)的綴合物，其中所述mPEG分枝之一的分子量在10kDa和14kDa之間，和另一mPEG分枝的分子量在17kDa和23kDa之間。

【技術(shù)特征摘要】
【國(guó)外來華專利技術(shù)】2014.01.08 CU CU-2014-00031.包含促紅細(xì)胞生成素(EPO)和含有兩個(gè)單甲氧基聚乙二醇(mPEG)分枝的不對(duì)稱支化聚合物結(jié)構(gòu)的綴合物，其中所述mPEG分枝之一的分子量在10kDa和14kDa之間，和另一mPEG分枝的分子量在17kDa和23kDa之間。2.根據(jù)權(quán)利要求1的綴合物，其中所述mPEG分枝之一的分子量為12kDa，和另一mPEG分枝的分子量為20kDa。3.根據(jù)權(quán)利要求1的綴合物，其中所述不對(duì)稱支化聚合物結(jié)構(gòu)如下所示：4.根據(jù)權(quán)利要求3的綴合物，其中mPEG1的分子量為12kDa且mPEG2的分子量為20kDa，或者mPEG1的分子量為20kDa且mPEG2的分子量為12kDa。5.根據(jù)權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)的綴合物，其中所述EPO為重組的人EPO(rhEPO)。6.藥物...

【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：R·派斯梅雷萊斯，D·E·阿馬羅岡薩雷斯，F·R·卡斯特羅奧迪奧，Y·埃爾南德斯瓦爾德斯，G·A·魯伊斯埃斯特拉達(dá)，
申請(qǐng)(專利權(quán))人：遺傳工程與生物技術(shù)中心，分子免疫中心，
類型：發(fā)明
國(guó)別省市：古巴;CU