一種香加皮的指紋圖譜及其質(zhì)量檢測(cè)方法技術(shù)

本發(fā)明專利技術(shù)涉及一種香加皮的有效成分測(cè)定方法，其特征在于，所述方法包括以下步驟：(1)對(duì)照品溶液的制備：稱取綠原酸、4-甲氧基水楊醛、杠柳毒苷對(duì)照品，加甲醇制得混合對(duì)照品溶液；(2)供試品溶液的制備：取香加皮干燥粉碎，過(guò)篩，精密稱取，加入甲醇溶液，提取20-50min，放冷，離心，取上清液，即得供試品溶液；(3)測(cè)定法：吸取混合對(duì)照品溶液和供試品溶液，注入超高效液相色譜儀，得到色譜圖，根據(jù)色譜圖計(jì)算供試品中相應(yīng)成分的含量。

【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】

：本專利技術(shù)涉及一種中藥的檢測(cè)方法，特別涉及一種中藥香加皮的指紋圖譜的建立及有關(guān)成分的含量測(cè)定方法
技術(shù)介紹
：香加皮為蘿摩科植物杠柳Periploca sepium Bge.的干燥根皮，辛、苦，溫；有毒。歸肝、腎、心經(jīng)。具有利水消腫，祛風(fēng)濕，強(qiáng)筋骨之功效，目前臨床上也常用于治療慢性心衰。香加皮原植物杠柳為野生，未有規(guī)范種植基地，藥材質(zhì)量很難控制，其中所含強(qiáng)心苷類物質(zhì)(杠柳毒苷等)既為有效成分，又為有毒成分，臨床應(yīng)用中亦常出現(xiàn)中毒現(xiàn)象。2010版《中國(guó)藥典》只對(duì)4-甲氧基水楊醛進(jìn)行了含量測(cè)定，指標(biāo)單一，難以控制香加皮的整體質(zhì)量。但香加皮在應(yīng)用中存在著混用嚴(yán)重，誤用、過(guò)量或長(zhǎng)期服用均易產(chǎn)生中毒現(xiàn)象，存在安全隱患。毒性未受重視。香加皮具有多種藥理作用，近年來(lái)，香加皮作為傳統(tǒng)中藥常用于治療慢性充血性心衰，但在用藥中常見(jiàn)不良反應(yīng)和致死性病例的報(bào)道，這與其自身毒性有關(guān)。2010版中國(guó)藥典中雖注明香加皮有毒，但其含量測(cè)定項(xiàng)下只有4-甲氧基水楊醛一個(gè)指標(biāo)，此成分是香加皮的主要香氣成分，無(wú)法代表香加皮的藥效和毒性，因此不能對(duì)香加皮的質(zhì)量進(jìn)行有效控制。近年來(lái)，香加皮作為傳統(tǒng)中藥治療慢性充血性心衰有其獨(dú)特優(yōu)勢(shì)，目前應(yīng)用也越來(lái)越多，但強(qiáng)心苷安全窗小，藥材含量波動(dòng)大，作用強(qiáng)，一直以來(lái)頻有中毒現(xiàn)象發(fā)生。香加皮的安全監(jiān)管勢(shì)在必行。有毒成分波動(dòng)大。香加皮原植物杠柳多生于山野、河邊、砂質(zhì)地，采收期為春、秋兩季，主產(chǎn)地為山東、山西、河北、河南4省，其中以山西、河南產(chǎn)量最大，此外四川、甘肅、湖南、遼寧、吉林、江蘇等地亦有產(chǎn)。產(chǎn)地分布范圍大，采收期也有春、秋之別，使得香加皮藥材中各成分差異大，質(zhì)量波動(dòng)不穩(wěn)定。近年來(lái)，關(guān)于香加皮質(zhì)控的文獻(xiàn)有：同時(shí)測(cè)定4-甲氧基水楊醛和杠柳毒苷，同時(shí)測(cè)定4-甲氧基水楊醛、杠柳毒苷和異香草醛。同時(shí)測(cè)定香加皮中以4-甲氧基水楊醛、綠原酸和杠柳毒苷的含量未報(bào)道過(guò)。目前對(duì)于指紋圖譜的研究?jī)H有李丹毅進(jìn)行了香加皮HPLC指紋圖譜研究，針對(duì)香加皮化學(xué)成分、質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)等方面的研究多為單一成分為指標(biāo)的含量測(cè)定分析，李丹毅等開(kāi)展了香加皮指紋圖譜的研究，但所建立的HPLC指紋圖譜檢測(cè)時(shí)間為80分鐘，分析耗時(shí)長(zhǎng)，損耗試劑多，不利于進(jìn)行多批次樣本的分析。因此，急需建立一種檢測(cè)更加全面、更快速的香加皮質(zhì)量評(píng)價(jià)方法。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
：本專利技術(shù)提供一種香加皮有效成分的測(cè)定方法、超高液相指紋圖譜的建立方法以及采用此方法得到的超高效液相標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照指紋圖譜。根據(jù)本專利技術(shù)所提供的香加皮的有效成分測(cè)定方法，包括以下步驟：(1)對(duì)照品溶液的制備稱取綠原酸、4-甲氧基水楊醛、杠柳毒苷對(duì)照品，加甲醇制得混合對(duì)照品溶液；(2)供試品溶液的制備取香加皮干燥粉碎，過(guò)篩，精密稱取，加入甲醇溶液，提取20-50min，放冷，離心，取上清液，即得供試品溶液；(3)測(cè)定法：吸取混合對(duì)照品溶液和供試品溶液，注入超高效液相色譜儀，得到色譜圖，根據(jù)色譜圖計(jì)算供試品中相應(yīng)成分的含量。其中，超高效液相色譜儀的色譜條件如下：色譜柱選自：C18色譜柱，流動(dòng)相：0.1％-1％磷酸水溶液-甲醇流動(dòng)相，進(jìn)行梯度洗脫，流動(dòng)相的流速為0.1-0.5mL/min，柱溫30-40℃，檢測(cè)波長(zhǎng)：220-230nm。根據(jù)本專利技術(shù)的測(cè)定方法，步驟(1)中混合對(duì)照品溶液中綠原酸、4-甲氧基水楊醛、杠柳毒苷的濃度范圍分別為0.332mg·L-1-33.2mg·L-1、1.61mg·L-1-161.1mg·L-1、0.968mg·L-1-96.8mg·L-1。本專利技術(shù)最優(yōu)選的對(duì)照品溶液的制備方法為：分別取綠原酸、4-甲氧基水楊醛、杠柳毒苷對(duì)照品適量，精密稱定，甲醇溶解，搖勻，制成質(zhì)量濃度分別為33.2mg·L-1、161.1mg·L-1、96.80mg·L-1的混合對(duì)照品貯備液，存貯于4℃冰箱中備用。精密量取混合對(duì)照品貯備溶液5mL，置10mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，作為含量測(cè)定用混合對(duì)照溶液，綠原酸、4-甲氧基水楊醛、杠柳毒苷質(zhì)量濃度分別為16.62mg·L-1、8.05mg·L-1、4.84mg·L-1，存貯于4℃冰箱中備用。根據(jù)本專利技術(shù)，流動(dòng)相為0.1％磷酸水溶液-甲醇，梯度程序如下：根據(jù)本專利技術(shù)的實(shí)施方式之一，梯度程序優(yōu)選為：0～3min,10％～25％甲醇；3～8min,25％～37％甲醇；8～11.5min,37％～45％甲醇；11.5～13min,45％～57％甲醇；13～19min,57％～90％甲醇；19～20min,90％甲醇。根據(jù)本專利技術(shù)的另一實(shí)施方式，梯度程序可以為：根據(jù)本專利技術(shù)的測(cè)定方法，所述步驟(3)中溶液的進(jìn)樣量可以為0.5-2μL。根據(jù)本專利技術(shù)，最優(yōu)選的色譜條件為：WATERS ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱(2.1mm×100mm，1.7μm)。流動(dòng)相0.1％磷酸水溶液(A)-甲醇(B)；梯度洗脫：0～3min,10％～25％B；3～8min,25％～37％B；8～11.5min,37％～45％B；11.5～13min,45％～57％B；13～19min,57％～90％B；19～20min,90％B。流速0.3mL·min-1；檢測(cè)波長(zhǎng)220nm；柱溫35℃；進(jìn)樣量1μL。3種成分的理論塔板數(shù)均不低于6000，此色譜條件檢測(cè)時(shí)間短，信息量豐富，亦用于指紋圖譜的分析，對(duì)照品及樣品圖譜見(jiàn)附圖1。根據(jù)本專利技術(shù)的測(cè)定方法，所述步驟(2)中提取方法可以為超聲提取、回流提取或索氏提取。根據(jù)本專利技術(shù)所提供的方法，步驟(2)中香加皮的稱樣量為0.125g-1.000g。根據(jù)本專利技術(shù)，最優(yōu)選的供試品溶液的制備方法為：樣品干燥粉碎，分別取各樣品粉末(過(guò)三號(hào)篩)0.25g，精密稱定，置于25mL容量瓶中，加入30％甲醇溶液20mL，超聲提取40min(功率500W，頻率40kHz，水溫在25℃以下)，放冷，30％甲醇溶液稀釋至刻度，搖勻，取適量至離心管中，于15000r·min-1下高速離心10min，取上清液，即得。供試品的提取時(shí)間會(huì)影響最終圖譜的出峰情況，40min的出峰個(gè)數(shù)最多，信息豐富，而提取時(shí)間低于10min則提取不完全。因此，在步驟(2)中最優(yōu)選的提取時(shí)間為40min。根據(jù)本專利技術(shù)的測(cè)定方法，采用該方法得到的指紋圖譜相對(duì)保留時(shí)間為：本專利技術(shù)的另一目的是提供一種香加皮超高液相指紋圖譜的建立方法，包括以下步驟：(1)對(duì)照品溶液的制備分別取綠原酸、4-甲氧基水楊醛、杠柳毒苷對(duì)照品，加甲醇溶解制成質(zhì)量濃度分別為0.332mg·L-1-33.2mg·L-1、1.61mg·L-1-161.1mg·L-1、0.968mg·L-1-96.8mg·L-1的混合對(duì)照品貯備液。(2)供試品溶液的制備取香加皮干燥粉碎，過(guò)篩，精密稱取，加入30％甲醇溶液，采用超聲提取、回流提取或者索氏提取40min，放冷，離心，取上清液，即得供試品溶液。(3)獲得色譜圖以對(duì)照品溶液作為參照物，將供試品溶液和對(duì)照品溶液注入超高效液相色譜儀，得到色譜圖，其中，所述超高效液相色譜儀的色譜條件如下：色譜柱選自：C18色譜柱，流動(dòng)相：0.1％磷酸水溶液-甲醇流動(dòng)相，進(jìn)行梯度洗脫。梯度程序?yàn)?～3min,10％～25％甲醇；3～8min,25％～37％甲醇；8～11.5min,37％～45％甲醇；11.5～13min,45％～57％甲醇本文檔來(lái)自技高網(wǎng)...

【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
一種香加皮的有效成分測(cè)定方法，其特征在于，包括以下步驟：(1)對(duì)照品溶液的制備稱取綠原酸、4?甲氧基水楊醛、杠柳毒苷對(duì)照品，加甲醇制得混合對(duì)照品溶液；(2)供試品溶液的制備取香加皮干燥粉碎，過(guò)篩，精密稱取，加入甲醇溶液，提取20?50min，放冷，離心，取上清液，即得供試品溶液；(3)測(cè)定法：吸取混合對(duì)照品溶液和供試品溶液，注入超高效液相色譜儀，得到色譜圖，根據(jù)色譜圖計(jì)算供試品中相應(yīng)成分的含量；其中，所述超高效液相色譜儀的色譜條件如下：色譜柱選自：C18色譜柱，流動(dòng)相：0.1％?1％磷酸水溶液?甲醇流動(dòng)相，進(jìn)行梯度洗脫，流動(dòng)相的流速為0.1?0.5mL/min，柱溫30?40℃，檢測(cè)波長(zhǎng)：220?230nm。

【技術(shù)特征摘要】
1.一種香加皮的有效成分測(cè)定方法，其特征在于，包括以下步驟：(1)對(duì)照品溶液的制備稱取綠原酸、4-甲氧基水楊醛、杠柳毒苷對(duì)照品，加甲醇制得混合對(duì)照品溶液；(2)供試品溶液的制備取香加皮干燥粉碎，過(guò)篩，精密稱取，加入甲醇溶液，提取20-50min，放冷，離心，取上清液，即得供試品溶液；(3)測(cè)定法：吸取混合對(duì)照品溶液和供試品溶液，注入超高效液相色譜儀，得到色譜圖，根據(jù)色譜圖計(jì)算供試品中相應(yīng)成分的含量；其中，所述超高效液相色譜儀的色譜條件如下：色譜柱選自：C18色譜柱，流動(dòng)相：0.1％-1％磷酸水溶液-甲醇流動(dòng)相，進(jìn)行梯度洗脫，流動(dòng)相的流速為0.1-0.5mL/min，柱溫30-40℃，檢測(cè)波長(zhǎng)：220-230nm。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的測(cè)定方法，其特征在于，其中，步驟(1)中混合對(duì)照品溶液中綠原酸、4-甲氧基水楊醛、杠柳毒苷的濃度范圍分別為0.332mg·L-1-33.2mg·L-1、1.61mg·L-1-161.1mg·L-1、0.968mg·L-1-96.8mg·L-1。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的測(cè)定方法，其特征在于，流動(dòng)相為0.1％磷酸水溶液-甲醇，梯度程序如下：4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的測(cè)定方法，其特征在于，梯度程序如下：0～3min,10％～25％甲醇；3～8min,25％～37％甲醇；8～11.5min,37％～45％甲醇；11.5～13min,45％～57％甲醇；13～19min,57％～90％甲醇；19～20min,90％甲醇。5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的測(cè)定方法，其特征在于，梯度程序如下：6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的測(cè)定方法，其特征在于，所述步驟(3)中，溶液的進(jìn)樣量為0.5-2μL。7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的測(cè)定方法...

【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：鄂秀輝，李麗，何毅，宋兆輝，
申請(qǐng)(專利權(quán))人：天士力制藥集團(tuán)股份有限公司，
類型：發(fā)明
國(guó)別省市：天津;12